以往的實驗室檢查有梅毒螺旋體檢查，梅毒血清試驗和腦脊液檢查。隨著基因診斷技術的發(fā)展，PCR技術應用檢測梅毒螺旋體DNA，使梅毒的診斷變得準確、快速、敏感。

　　一、梅毒螺旋體檢查（一） 檢查方法1、暗視野顯微鏡檢查：在皮損處，用玻片刮取組織滲出液或淋巴結穿刺液，見有活動的梅毒螺旋體。

　　2、免疫熒光染色：在熒光顯微鏡下可見綠色的梅毒螺旋體。

　　3、活體組織檢查梅毒螺旋體，如用銀染色法（Warthin-starry）法或（Levoaditis法）或熒光抗體染色，可查見梅毒螺旋體，呈黑褐色，有螺旋結構，位于真皮毛細血管周圍。銀染色的陽性結果需謹慎解釋，因為類似梅毒螺旋體的其他物質易混淆。而特異性熒光檢查則更為可靠。

　?。ǘ┞菪w的鑒別鏡下檢查梅毒螺旋體與雅司、地方性梅毒、品他三種非性病性螺旋體鑒別，此外還應與齒大螺旋體、齒小螺旋體、軟螺旋體、生殖器螺旋體相鑒別。

　　1、雅司、地方性梅毒、品他三種非性病螺旋體：形態(tài)上不能與梅毒螺旋體相區(qū)別，但流行病學、病史、臨床表現可以鑒別；

　　2、齒大螺旋體：為疏螺旋體，比梅毒螺旋體長，存在于口腔中，尤其在齒縫內最多；

　　3、齒小螺旋體：比梅毒螺旋體短，旋距也短，運動不規(guī)則，兩端較中部略寬。主要見于齒垢中；

　　4、軟螺旋體：為疏螺旋體，螺旋較少，運動不規(guī)律且快，常不斷改變其形態(tài)。寄生于皮膚潰瘍中。

　　5、生殖器螺旋體：比梅毒螺旋體短小，螺旋體大而不規(guī)則，生于陰垢內，不經常清洗者檢出率較高。

　　6、其他：與螺旋形網狀纖維、纖維蛋白細絲、纖毛、串狀紅細胞等呈螺旋狀的物體相鑒別。

　　二、梅毒血清試驗根據所用抗原不同，梅毒血清試驗分為以下兩大類：

　?。ㄒ唬┓敲范韭菪w抗原血清試驗用心磷脂作抗原，測定血清中抗心磷脂抗體，亦稱反應素。本試驗敏感性高而特異性較低，且易發(fā)生生物學假陽性。早期梅毒患者經充分治療后，反應素可以消失，早期未經治療者到晚期，部分病人中反應素也可以減少或消失。目前一般作為篩選和定量試驗，觀察療效，復發(fā)及再感染。

　　1、性病研究實驗室試驗（Venereal Disease Research Laboratory test，VDRL）

　　用心磷脂、卵磷脂及膽固醇為抗原，可作定量及定性試驗，試劑及對照血清已標準化，費用低。此法常用，操作簡單，需用顯微鏡讀取結果，缺點是一期梅毒敏感性不高。

　　2、快速血漿反應素試驗（Rapid Plasma reagin test， RPR）

　　是VDRL抗原的改良，敏感性及特異性與VDRL相似，優(yōu)點是肉眼即可讀出結果。

　　3、不加熱血清反應素玻片試驗（Unheated Serum Reagin USR）

　　也是VDRL抗原的改良，敏感性及特異性與VDRL相似。

　　（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗用活的或死的梅毒螺旋體或其成分來作抗原測定抗螺旋體抗體。這種試驗敏感性和特異性均高，一般用作證實試驗。這種試驗是檢測血清中抗梅毒螺旋體IgG抗體，即使患者經過足夠治療，仍能長期存在，甚至終身不消失，血清反應仍持續(xù)存在陽性，因此，不能用于觀察療效。

　　1、熒光梅毒螺旋抗體吸收試驗（FTA-ABS Test）：此法是較敏感和較特異的螺旋體試驗。

　　2、梅毒螺旋體血凝試驗（TPHA）：敏感性和特異性均高，操作簡便，但對一期梅毒不如FTA-ABS試驗敏感。

　　3、梅毒螺旋體制動試驗（Treponema Pallidum immobilization ，TPI）；用Nichol株螺旋體（活的）加病人血清（含抗體）后，在補體的參與下可抑制螺旋體的活動。如≥50%梅毒螺旋體停止活動，則為陽性。此試驗特異性、敏感性均高，但設備要求高，操作難，僅供研究用。

　　三、基因診斷技術檢測梅毒螺旋體梅毒螺旋體不能進行體外培養(yǎng)。檢測臨床標本中梅毒螺旋體最敏感、可靠的方法是兔感染試驗（RIT），RIT能證實活的梅毒螺旋體存在，是檢測梅毒螺旋體常用的標準方法。然而用RIT對新生兒或成人梅毒進行常規(guī)診斷不切合實際。梅毒的血清學診斷對確定感染及治療很有意義，但對早期梅毒診斷不敏感，對先天性及神經性梅毒的診斷不夠特異。血清學試驗用作先天性梅毒的輔助診斷，其首要問題是將無癥狀感染嬰兒從非感染嬰兒區(qū)別開來，這些嬰兒的母親梅毒血清試驗陽性，困難在于不能將母親體液免疫反應同嬰兒的抗體反應相區(qū)別，因為母親的IgG可傳遞給胎兒。另外由于IgG終身存在，所以很難評價治療結果。血清學診斷常常又存在著假陽性。CR檢測梅毒螺旋體DNA，特異性很強，敏感性很高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進方法。

　　（一）PCR引物的設計部位與序列：

　　目前有四套擴增梅毒螺旋體DNA的系統：擴增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），擴增39KDa堿性膜蛋白基因（bmp基因），擴增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和擴增tmpA基因。

　　三種擴增系統的引物序列：

　　47-1 CACAATGCTCACTGAGGATAGT 648-669 47-2 ACGCACAGAACCGAATTCCTTG 1284-1035 Tpp47-3 TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC 713-734 47-4 TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT 1187-1208 TP3 CAGGTAACGGATGCTGAGT 256-275 TP4 CGTGGCAGTAACCGCAGTCT 762-741 bmpTP5（探針） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519 TP7 CTCAGCACTGCTGAGCGTAG 172-191 TP8 AACGCCTCCATCGTCACACC 788-769 F1 CTCTTCAAGGAGCTCAT 222-206 Tpf-1F2 AGACAGTGGTTATGCTC 77-61或tyf-1F3（探針）ATTGCGCCAGCATGTAG 114-130 F4（探針）ATTGCGCCGGCATGTAG 114-130

　?。ǘ┎僮鞣椒?、采集標本，根據病人的情況可采取局部分泌物，抽取淋巴結液，羊水，血清，腦脊液。用適量的蒸餾水稀釋，保存于4℃冰箱。

　　2、標本處理：目的是為了暴露梅毒螺旋體的DNA，消除標本對PCR的抑制物。采用下列處理方法。

　　①煮沸法：取10或20μl血清或CSF放入0.5ml微量離心管中，水浴煮10min后在冰浴中冷卻，13000g離心10s，上清用作PCR分析。

　?、诘退匐x心法：將100μl羊水，血清或腦脊液加入到900μl無菌磷酸緩沖液中，10000g室溫離心10min，上清轉入另外的微量離心管中，20000g4℃離心1h，棄上清，沉淀懸浮于50μl無菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷卻，取40μl上清作PCR.③堿裂解法：取收集標本100μl加于含1mol/L NaCl，1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min，用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl（pH8.0）中和。用相同體積的苯酚抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整個600μl的溶液用相同體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，然后用相同體積的異丙醇沉淀（-20℃過液）。13000g4℃離心15min，輕輕倒出上清，涼干。沿淀懸浮于51μl無菌水中，取20μl作PCR模板。

　?。ㄈ㏄CR擴增1、擴增47KDa膜抗原基因100ml反應物含：10mmol/L TrisHCl（pH8.3），50mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，100μg/ml明膠，0.5μg引物（47-1和47-2），75mmol/LdNTPs，2.5U TaqDNA聚合酶。取不同量各種制備的DNA作模板，反應過程：94℃15s，60℃1min， 72℃1min，循環(huán)40次，末次循環(huán)增加72℃10min延伸時間，取10ml反應物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。點雜交分析產物：取10mlPCR擴增產物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中變性10min，用380μ11.5mol/L NaCl-1mmol/L Tris（pH7.2）中和，然后用Minifold I點膜，80℃真空處理膜2h，用496bp探針65℃雜交過夜。探針為引物47-3和47-4的PCR產物，用隨機引物法標記. 2、擴增39KDa堿性膜蛋白基因25μ1反應體系含：1×RT緩沖液，50mmol/L Tris-HCl（pH8.5），50mmol/LNaCl，4mmol/LMgCl2，2mmol/L DTT（二硫基蘇糖醇），200μmol/L dNTP，100μmol/L引物（TP7和TP8），0.01%牛血清白蛋白（無DNase和RNase），1UTaqDNA聚合酶，5μ1樣品，可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增強PCR. PCR1：先用引物TP7和TP8擴增出617bp片段，反應過程：94℃3min后進入循環(huán)過程：94℃1min，65℃1min，72℃1min，循環(huán)數為30或35，每一循環(huán)中72℃延伸遞增5s，最后一次延伸時間延長到6min. PCR2：再用巢居引物TP3和TP4擴增出500bp片段，PCR1產物用蒸餾水稀釋10倍，取5μ1用作第二次擴增.PCR2中MgCl2和引物濃度分別為5mmol/L和20μmol/L引物（TP3和TP4），其它條件與PCR1相同。

　　PCR產物分析。①取10μ1反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳；②Southern印跡后，用寡核苷酸探針TP5（以32P作末端標記）雜交。

　　3、擴增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因100μ1反應物含：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl（pH8.4），2.5mmol/L MgCl2，0.2mg/ml明膠，1μmol/L dNTP，2mmol/L引物（F1和F2），2.5UTaqDNA聚合酶，10μ1經處理的兔睪丸梅毒螺旋體懸液，反應過程：94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 2.5min，循環(huán)40次，取10μ1PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，Southern印跡后，用tpf-1特異的探針F3和tyf-1特異物的探針F4分別雜交。

　　為使擴增效率達到最大，反應參數應選擇最佳數值。使用大片段雙股DNA探針檢測PCR產物，而不用合成的寡核苷酸探針，因為這樣可通過標記得到較高、特異的放射活性。另外，大片段探針能最大減少野生株tpp47可變序列的假陰性結果及由于Taq DNA聚合酶的錯誤導致堿基替代的假陰性結果。實驗證實：PCR的敏感性確能達到檢測單一tpp47拷貝的水平。

　　由于臨床標本可能含有大量人細胞和微生物，建立對梅毒螺旋體高度特異的PCR方法是很重要的。盡管大量數椐支持47Da膜抗原基因及其相應基因具梅毒螺旋體特異性，還應深入研究該方法的特異性。在EB染色的瓊脂糖凝膠偶而可見非特異的PCR產物，（如擴增淋病奈氏球菌）時就需要用tpp47特異的探針雜交來增加特異性及敏感性。僅從梅毒螺旋體梅毒亞種和雅司亞種染色體DNA獲得了特異的PCR產物，表明了病原性螺旋體非常相近的親緣關系及47Da免疫蛋白高度保守的抗原性。擴增tpp47不能如常規(guī)法那樣能區(qū)分梅毒螺旋體和伯氏疏螺旋體，在用血清學試驗診斷梅毒和萊姆疾病時，這兩種螺旋體有交叉反應。

　　梅毒螺旋體梅毒亞種 tpf-1基因在123位置為A，雅司亞種tpf-1基因在123位置為G，Noordhoek用tpf-1或tpf-1特異的寡核苷酸探針（兩種探針僅一個核苷酸不同）檢測不同菌株tpf-1或tpf-1基因的擴增產物。結果表明：不能根據tpf-1或tyf-1基因123位置核苷酸的不同來區(qū)別梅毒亞種。這些菌種從梅毒患者分離，一些已用兔傳代多次，通過對新鮮臨床標本中梅毒螺旋體DNA的分析比較，以上結果可能是由于梅毒螺旋體在傳代中點突變所致。

　　四、 腦脊液檢查用于診斷神經性梅毒，包括細胞計數，蛋白量，VDRL試驗、PCR檢測、膠體金試驗等。為除外無癥狀神經梅毒，所有梅毒病人凡病期超過一年者均應作腦脊液檢查。所有早期胎傳梅毒嬰兒也應檢查腦脊液以除外中樞神經系統受累的可能。腦脊液細胞計數和總蛋白量的增加屬非特異性變化，腦脊液VDRL試驗才是神經梅毒的較可靠診斷依據。但是，當有活動的神經梅毒存在時，腦脊液白細胞計數常增高（WBC＞5/mm3），因此，腦脊液白細胞計數也常常是判斷療效的敏感指標。有條件的單位行腦脊液PCR檢測，可以快速準確的診斷神經性梅毒。

　　五、 梅毒血清反應的假陽性技術性假陽性：抗原敏感性過高，血清標本弄錯或溶血或細菌污染，檢查室技術不熟練。

　　生物學假陽性：非螺旋體抗原血清試驗陽性率高于螺旋體抗原血清試驗。前者是檢測的病人的反應素，后者是檢測抗梅毒螺旋體抗體。由于非螺旋體試驗所用抗原也存在于其他組織，所以其他疾病甚至偶見正常人也出現反應素，因此在某些疾病中發(fā)生陽性反應，針對梅毒而言稱為假陽性反應。

　　1、急性生物學假陽性：

　　這些疾病在6個月內轉陰。見于麻疹、水痘、風疹、傳染性單核細胞增多癥、上呼吸道感染、猩紅熱、亞急性細菌性心內膜炎、肺炎球菌性肺炎、活動性肺結核、絲蟲病、斑疹傷寒、錐蟲病、回歸熱、鉤端螺旋體、瘧疾，但滴度很低，一般在1：8以下，當用螺旋體抗原血清FTA-ABS或TPHA試驗檢測，血清反應陰性。PCR檢測陰性。

　　2、慢性生物學假陽性，可持續(xù)6個月以上或數年，甚至終身，可分為兩類：

　?。?）非螺旋體抗原血清試驗假陽性；這些疾病常見于自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、播散性盤狀紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血、進行性系統性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、風濕性心臟病、肝硬化、結節(jié)性多動脈炎、干燥綜合征、慢性腎炎及海洛因成癮，滴度可達1∶64～1∶128；少數孕婦，正常人群假陽性率為1%-2%.在70歲以上高齡老人中有1%出現假陽性。

　　（2）螺旋體抗原血清假陽性；發(fā)生率比非螺旋體抗原血清試驗少，雖有部分其他病的患者出現FTA-ABS假陽性，其熒光染色常很弱或呈不典型的“串珠狀”。

　?。?）梅毒血清反應的假陰性a.一期梅毒硬下疳：一般硬下疳出現2-3周，機體才出現反應素，故早期血清反應常呈陰性。

　　b.感染梅毒立即治療或晚期梅毒：由于血清反應素低，出現陰性。

　　c.二期梅毒假陰性；不到1%的二期梅毒患者其未稀釋的血清VDRL試驗呈陰性或弱陽性反應，而在高度稀釋后反而為陽性，即前帶現象（Prozone phenomenon），這是血清中抗心磷脂抗體過多，抑制陽性反應的結果。

　　d.技術操作或抗原敏感性低出現血清試驗陰性。