血細(xì)胞常用的染色方法是檢驗(yàn)技師需要了解的知識(shí)，醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜索整理如下：

細(xì)胞涂片，在用普通光學(xué)顯微鏡觀察之前需要固定和染色。固定是將細(xì)胞蛋白質(zhì)和多糖等成分迅速交聯(lián)凝固，以保持其原有結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。染色的目的是使細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器等染上不同的顏色，便于顯微鏡下觀察。各種細(xì)胞涂片，常用的染色方法有瑞氏（Wright）、姬姆薩（Giemsa）、巴氏（PaPanicolaou）和蘇木素一伊紅比emat0Xylineosin，HE）染色。

一、染料與染色

染料（dyes）是一種具有顏色的有機(jī)化合物，最早用于織物的著色。隨著生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，顯微鏡技術(shù)的出現(xiàn)和逐步完善，科學(xué)家們用染料將生物組織細(xì)胞和病原體著色，以利在顯微鏡下觀察各種結(jié)構(gòu)，這種染料稱為生物學(xué)染色劑（biologystains，BS），生物染色劑的發(fā)現(xiàn)和利用促進(jìn)了醫(yī)學(xué)生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。

（一）細(xì)胞學(xué)的基本染料

染料可分為兩大類，即天然染料和人工合成染料。生物染色劑多屬于后者。各種生物學(xué)染色劑都具有產(chǎn)生顏色和與被染組織親合兩種性質(zhì)。這兩種性質(zhì)主要由兩種特殊基團(tuán)即發(fā)色基團(tuán)（chromophoro）和助色基團(tuán)（auxochrome）所產(chǎn)生。

所謂發(fā)色基團(tuán)，是染料產(chǎn)生顏色標(biāo)志的未飽和基團(tuán)。不同的有機(jī)化合物可以吸收不同波長(zhǎng)的光，如吸收可見(jiàn)光區(qū)以外的光，這些物質(zhì)是無(wú)色的；如吸收可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)某些波長(zhǎng)的光，這些物質(zhì)是有色的，其肉眼可見(jiàn)的顏色為被吸收光顏色的互補(bǔ)色。一般飽和芳香族化合物很少有可見(jiàn)光區(qū)的吸收帶，因而無(wú)顏色可見(jiàn)。相反，如苯的衍生物則具有此吸收帶而呈現(xiàn)顏色。這些化合物顯示的吸收帶與不穩(wěn)定價(jià)鍵（如π鍵）有關(guān)。對(duì)苯二酚是無(wú)色的，但氧化失去兩個(gè)氫原子時(shí)變?yōu)榫唿S色的對(duì)醌式結(jié)構(gòu)，這種使有機(jī)化合物在可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)產(chǎn)生光吸收的基團(tuán)稱為發(fā)色基團(tuán)，常見(jiàn)的發(fā)色基團(tuán)有烯基、炔基、羰基、偶氮基、亞硝基等。助色基團(tuán)是一種能使化合物發(fā)生電離作用的輔助原子團(tuán)，能與發(fā)色基團(tuán)構(gòu)成更完整的共軛體系，使分子激發(fā)能進(jìn)一步降低，染料的色澤加深并使其與被染組織更具親合力，染料的助色基團(tuán)是使染料成為鹽類的部分，助色基團(tuán)的性質(zhì)決定染料在水溶液中的荷電性，常見(jiàn)的助色基團(tuán)有羥基、竣基、氨基等。根據(jù)助色基團(tuán)的性質(zhì)，將生物學(xué)染色劑分成堿性染料和酸性染料兩大類，即能接受質(zhì)子者為堿性染料，能釋放質(zhì)子者為酸性染料。

1、堿性染料（basicdyes） 屬苯胺類藍(lán)色染料，如噻嗪（thiazins）系列，包括亞甲藍(lán)（methyleneblue）、天青A（azure A）、天青B（azureB）、天青C（azureC）和硫堇（thionine），它們的區(qū)別在于結(jié)合甲基的數(shù)量。以天青B為例，它含有兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)，一個(gè)次氨基（－N一）和一個(gè)鄰醌式基團(tuán)。助色基團(tuán)為氨基（一NH2），結(jié)合一個(gè)質(zhì)子后荷正電，亦稱陽(yáng)離子染料。因此，這些染料與細(xì)胞內(nèi)的酸性成分，如DNA、RNA、特異的中性顆?；|(zhì)、某些胞漿蛋白等結(jié)合，主要是染細(xì)胞核的染料。還有一個(gè)很重要染核染料是蘇木（hematoxyline），屬媒染料（mordantdyes），需媒染劑（如Al3+）參與才能使細(xì)胞核著色。

2、酸性染料（aciddyes） 細(xì)胞學(xué)較重要的酸性染料有兩大類，即熒烷一氧雜蒽染料（horane－xanthenedyes）和偶氮染料（azodyes）。前者是一類以氧雜蒽和醌式苯環(huán)作為發(fā)色基團(tuán)，以羧基（－COOH）為助色基團(tuán)的染料，因?yàn)轸然芴峁┮粋€(gè)質(zhì)子，亦稱“陰離子染料”。這類染料的代表是伊紅Y（eosinY，俗稱黃色伊紅）和伊紅B（eosinB，俗稱藍(lán)色伊紅）。這兩種染料特別適于與噻嗪類染料（亞甲藍(lán)，天青B等）作對(duì)比染色，形成紅藍(lán)分明、色澤艷麗的結(jié)果，因?yàn)橐良t具較強(qiáng)的擴(kuò)散吸附染色特性。酸性偶氮類染料有橙黃G（orangeG）、剛果紅（congored）、亮藏花精（brilliantcrocein）等。由于酸性染料是陰離子型染料，因此它們與細(xì)胞中的堿性成分結(jié)合并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分及胞漿中的一些蛋白質(zhì)。

除上述酸性和堿性染料外，有的還將在同一條件下既具陰離子型又有陽(yáng)離子型的染色劑稱復(fù)合染料，如瑞氏染色劑、姬姆薩染色劑等。

（二）染色原理

細(xì)胞著色的原理至今雖無(wú)滿意的解釋，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是物理作用和化學(xué)作用綜合的結(jié)果。

1、物理作用

包括毛細(xì)管現(xiàn)象和滲透、吸收、吸附作用等。通過(guò)這些因素，染料的色素粒子就能順利地進(jìn)入組織、細(xì)胞并與其牢固結(jié)合而著色。

瑞氏染色法

Wrfeht和Giemsa都于1902年報(bào)告了各自的新的血液學(xué)染色劑，其主要特點(diǎn)是在制備多色性亞甲藍(lán)（主要指天青B）方面做了改進(jìn)，使血細(xì)胞和瘧原蟲(chóng)著色較好，操作簡(jiǎn)便。

上述染色法均是含伊紅和亞甲基藍(lán)衍生物的復(fù)合染料。在臨床檢驗(yàn)工作中，瑞氏染色法常用于血液、其他體液、分泌物和排泄物涂片中各種細(xì)胞的染色，有利于在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類檢查。

【染色原理】

瑞氏染色分兩相進(jìn)行，第一相是酸性染料伊紅與細(xì)胞中的堿性物質(zhì)如血紅蛋白、嗜酸性顆粒等結(jié)合；堿性染料天青B與細(xì)胞中的酸性物質(zhì)如核染色質(zhì)（chro－matin）、特異中性顆粒、血小板及富含核蛋白的胞質(zhì)結(jié)合。第二相是天青B和伊紅在適宜條件下形成紫色的天青B一伊紅復(fù)合物（azureB－eosincomplex），這種復(fù)合物是形成Romanowsky－Giemsa效應(yīng)的基礎(chǔ)。

Romanowsky－Giemsa效應(yīng)包括：①白細(xì)胞核染色質(zhì)染成紫色，瘧原蟲(chóng)的染色質(zhì)染成紅色；②中性粒細(xì)胞的顆粒及血小板顆粒區(qū)染成紫色；③產(chǎn)生本效應(yīng)必須有兩種染料參與，一種是天青B，另一種是伊紅。

Wittekind（1985）指出，天青B與DNA分子中的磷酸基結(jié)合，而伊紅既與DNA分子中的陽(yáng)離子部位結(jié)合，又與天青B結(jié)合，與天青B的結(jié)合力來(lái)源于電子供一受體的電子轉(zhuǎn)移力，天青B的甲氨基（－NHCHs）與伊紅分子中的叛基（－COOH）間形成氫鍵。因此，天青B是噻嗪類染料中能與伊紅形成復(fù)合物的最佳選擇，因?yàn)閾碛兴膫€(gè)甲基側(cè)鏈的亞甲藍(lán)不能以氫鍵與伊紅結(jié)合。

甲醇除作為染料的溶劑，能將瑞氏染料解離成帶正電荷的天青B和帶負(fù)電荷伊紅外，因其具有脫水力，還可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)，并使蛋白沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料的接觸表面，增強(qiáng)染色效果。

細(xì)胞中的各種有機(jī)物質(zhì)（特別是蛋白質(zhì)）、染料等對(duì)環(huán)境的州值非常敏感。如環(huán)境偏酸，氫離子增多，降低對(duì)堿性染料的親和力；增強(qiáng)伊紅著色，出現(xiàn)異常紅染；相反，則可出現(xiàn)異常藍(lán)染。最佳環(huán)境應(yīng)維持在PH值64～6、8.因此，必須使用緩沖溶液。

【試劑】

1、Wright染液 瑞氏染粉0.1g；甲醇60.0ml.

將瑞氏染料放入清潔干燥乳缽里，加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，將已溶解的染料倒入棕色試劑瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料溶完，甲醇全部用完為止。或?qū)⑷鹗先痉酆图状贾苯又糜谧厣恐?，加碎玻璃適量，立即用力振蕩smin，置室溫中，連續(xù)3天，每天振搖2～3次，促其溶解。配好后放室溫，一周后即可使用。新配染液效果差，放置時(shí)間越長(zhǎng)天青B越多，染色效果越好。久置應(yīng)密封，以免甲醇揮發(fā)或氧化成甲酸，甲醇需用AR級(jí)。上述量染液中也可加中性甘油3ml，除可防止染色中甲醇過(guò)早揮發(fā)外，并可使細(xì)胞著色清晰。

1、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4～6.8）

磷酸二氫鉀（無(wú)水）0.3g；

磷酸氫二鈉（無(wú)水）0.2g；

蒸餾水加至1000ml.

配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。

【染色方法】

（1）用蠟筆在血膜兩頭劃線，然后將血片平放在染色架上；

（2）加瑞氏染液數(shù)滴，覆蓋整個(gè)血膜，固定細(xì)胞約lmin；

（3）滴加等量或稍多的緩沖液，與染液充分混勻，染色5～10min；

（4）用清水沖去染液，待干后鏡檢。

【染色結(jié)果】在正常情況下，血膜外觀染成淡紫紅色。顯微鏡下，紅細(xì)胞呈粉紅色，在厚薄均勻處，略有碟狀感；白細(xì)胞漿中顆粒清楚，并顯示出各種細(xì)胞特有的色彩。細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。

染色偏酸，則紅細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞顆粒偏紅，白細(xì)胞核呈淡藍(lán)色或不著色。染色偏堿，則所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，顆粒深暗。嗜酸性顆?？扇境砂岛稚?，甚至紫黑或藍(lán)色。中性顆粒偏粗、偏堿，染成紫黑色，血膜厚的部位呈綠色。

【注意事項(xiàng)】

1、未干透血膜的不能立即染色，否則染色時(shí)易脫落。

2、染色時(shí)間，與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)。梁液淡、室溫低、細(xì)胞多，則染色時(shí)間長(zhǎng)；反之則可減少染色時(shí)間。染液濃淡及染色時(shí)間長(zhǎng)短要摸索，特別是更換染液時(shí)更應(yīng)如此。

3、染液不能過(guò)少，以防蒸發(fā)沉淀，一旦染液沉淀在血膜上，則不易沖掉。

4、沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖去，以防染料沉著在血膜上。沖洗染料時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以防脫色。沖洗完的血片應(yīng)立放于架上，防止剩余水分浸泡脫色。

5、如血膜上有染料顆粒沉積，可用甲醇溶解，但需立即用水沖掉甲醇，以免脫色。

6、染色過(guò)談，可以復(fù)染，復(fù)架時(shí)應(yīng)先加緩沖液，創(chuàng)造良好染色環(huán)境，而后加染液，或加染液與緩沖液的混合液，不可先加染液。

7、染色過(guò)深可用水沖洗或浸泡一定時(shí)間，也可用甲醇脫色。

8、染色偏酸或偏堿時(shí)，均應(yīng)更換緩沖液再重染。