【摘要】  目的：觀察己酮可可堿（PTX）對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型的治療作用，探討血栓及血栓前狀態(tài)（PTS）在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的作用和己酮可可堿作用機(jī)制。 方法：用2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）造大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，將大鼠模型隨機(jī)分為模型組，模型+生理鹽水組，模型+己酮可可堿組，另設(shè)空白對(duì)照組，共4組。 觀察各組大鼠腸道大體形態(tài)和組織學(xué)改變；采用血小板黏附儀檢測(cè)血小板黏附功能（ PAdT），智能血液凝聚儀檢測(cè)血小板的聚集功能（PAgT）；ELISA法測(cè)定血清中的血栓烷B2（ TXB2）；單克隆酶聯(lián)吸附法檢測(cè)血管性假血友病因子相關(guān)抗原（vWF∶Ag）；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)粘附因子1（ICAM1）。 結(jié)果：與模型+生理鹽水組比較，模型+己酮可可堿組損傷指數(shù)下降（6.02±0.74 vs 0.85±0.50， P<0.01； 5.68±0.60 vs 1.08±0.45， P<0.01）；模型組血小板黏附率和聚集率與空白對(duì)照組無(wú)明顯增加（P>0.05）； 模型組TXB2， vWF∶Ag， ICAM1均較空白對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），經(jīng)己酮可可堿治療后，均較模型+生理鹽水組降低（P<0.05）。 結(jié)論：TNBS所誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型與PTS有一定關(guān)系。 PTX通過(guò)抗凝、抗炎癥介質(zhì)、抗細(xì)胞因子而發(fā)揮治療UC作用。

　　【關(guān)鍵詞】  己酮可可堿；結(jié)腸炎，潰瘍性；血小板功能試驗(yàn)；炎癥介質(zhì)；細(xì)胞因子

　　0引言

　　潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）發(fā)病機(jī)制尚未明確，在活動(dòng)期腸粘膜呈彌漫性充血水腫，且有出血點(diǎn)、潰瘍存在。 UC與血栓及血栓前狀態(tài)有密切的關(guān)系，并應(yīng)用肝素治療取得一定療效［1-2］。 抗凝常用藥己酮可可堿毒副作用小，使用安全，有抗血小板、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、免疫抑制作用等，因此可能對(duì)UC具有一定的抗炎作用。 本研究旨在探討己酮可可堿對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的治療作用及其作用機(jī)理。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康SD大鼠（由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供） 60只，雄性，體質(zhì)量150～200 g，正常喂養(yǎng)； 2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）為Sigma公司產(chǎn)品，血管性假血友病因子相關(guān)抗原（vWF∶Ag）， 血栓烷B2 （TXB2）檢測(cè)試劑盒，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院血栓與止血研究室提供；細(xì)胞內(nèi)粘附分子1（ICAM1）試劑盒購(gòu)自華美公司。 SH293智能血液凝聚儀（購(gòu)自上海生化儀器廠） ，血小板粘附兩用儀（無(wú)錫電子儀器二廠產(chǎn)）；己酮可可堿（PTX）（上海第十六制藥廠提供）。

　　1.2方法

　　1.2.1動(dòng)物分組及處理

　　將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)N組）， 模型組（簡(jiǎn)稱(chēng)M組）， 模型+生理鹽水組（簡(jiǎn)稱(chēng)NS組），模型+己酮可可堿組（簡(jiǎn)稱(chēng)PTX組）。 正常對(duì)照組、模型組各20只，其余每組10只。 正常對(duì)照組不作任何處理。

　　1.2.2大鼠UC模型的建立及處理

　　SD大鼠術(shù)前禁食24 h，自由飲水，實(shí)驗(yàn)時(shí)乙醚麻醉，用一直徑2.0 mm， 長(zhǎng)約12 cm的硅膠管由肛門(mén)輕緩插入深約8 cm，實(shí)驗(yàn)各組以含150 mg/kg TNBS的等體積乙醇溶液0.5 mL緩慢注入結(jié)腸，讓動(dòng)物保持平躺，自然清醒。 模型造成后（第4日），N組、M組各隨機(jī)選10只大鼠，禁食兩天后斷頸處死，處死前穿刺心臟取血，每只約2~3 mL，凍存?zhèn)溆?，所?0只正常喂養(yǎng)。 NS組以生理鹽水2 mL/次，PTX組按8 mg/kg（溶解于2 mL生理鹽水中）灌胃，2次/d. 3 wk各組大鼠全部處死，處死前穿刺心臟取血，每只約2~3 mL，凍存?zhèn)溆谩?所有處死大鼠，剖取遠(yuǎn)端結(jié)腸8 cm，沿縱軸切開(kāi)，生理鹽水迅速?zèng)_凈，置于標(biāo)本體積10倍以上的甲醛溶液中固定。

　　1.2.3結(jié)腸粘膜損傷評(píng)分

　　大體形態(tài)評(píng)分：將福爾馬林固定后的結(jié)腸標(biāo)本腸粘膜層向上平鋪于硬紙板上，用大頭針固定，并保持在生理鹽水中，用放大鏡觀察粘膜急性損傷程度，并按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：0分：無(wú)損傷；1分：局部充血、水腫但未出現(xiàn)潰瘍；2分：有潰瘍，但沒(méi)有明顯炎癥；3分：有潰瘍，僅有一處出現(xiàn)炎癥；4 分：有多處潰瘍和炎癥，潰瘍大小<1 cm；5分：有多處潰瘍和炎癥：至少有一處潰瘍大小>1 cm. 組織學(xué)損傷評(píng)分：包括潰瘍炎癥肉芽腫、纖維化，按有無(wú)及輕重計(jì)為0，1，2 分，病變深度（達(dá)粘膜下層1分，肌層2分，漿膜層3分） 各項(xiàng)相加得總分。

　　1.2.4血清指標(biāo)檢測(cè)方法

　　采用ELISA法檢測(cè)TXB2，單克隆酶聯(lián)吸附法檢測(cè)vWF∶Ag，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)ICAM1（均按試劑盒說(shuō)明）。 血小板粘附兩用儀檢測(cè)血小板粘附功能（PAdT）， 32 g/L枸櫞酸鈉按1∶9抗凝；用SH293智能血液凝聚儀檢測(cè)血小板的聚集功能（PAgT），用2 μmol/L二磷酸腺苷作誘導(dǎo)劑，測(cè)定最大聚集率。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，采用SPSS 10.0軟件包進(jìn)行方差分析及多重比較。

　　2結(jié)果

　　2.1一般情況

　　大鼠造模型1 d后，開(kāi)始逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)、拱背、厭食、大便次數(shù)增多、軟便或稀便、大便末端有粘液或膿點(diǎn)等表現(xiàn)。 3 d后癥狀達(dá)到高峰，大鼠毛色無(wú)華、變脆，嗜臥扎堆，大便完全為稀便，帶膿血。 N組大鼠無(wú)腹瀉、懶動(dòng)等異常改變。

　　2.2腸組織大體形態(tài)

　　造模型3 d后，M組處死大鼠結(jié)腸標(biāo)本表現(xiàn)為黏膜充血、水腫、潰瘍形成，結(jié)腸組織與周?chē)M織粘連。 而N組結(jié)腸標(biāo)本粘膜光滑，無(wú)潰瘍，腺體排列整齊（圖1A，B）。

　　2.3PTX對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎大體形態(tài)及組織學(xué)損傷的影響M組組大鼠結(jié)腸標(biāo)本表現(xiàn)為黏膜充血、水腫、潰瘍形成，結(jié)腸組織與周?chē)M織粘連，可見(jiàn)近端腸腔擴(kuò)張。 潰瘍呈線狀和灶狀，周?chē)梢?jiàn)黏膜增厚、腸腔狹窄。 光鏡下可見(jiàn)潰瘍及炎性滲出物，可見(jiàn)上皮細(xì)胞壞死、脫落，有淋巴組織增生，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)數(shù)量不等的單個(gè)核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，也可見(jiàn)增生的纖維母細(xì)胞。 PTX組黏膜水腫少見(jiàn)，無(wú)潰瘍和炎性滲出物，光鏡下腺體排列整齊， 僅見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷指數(shù)低于模型組及生理鹽水組（P<0.01， 表1，圖2A，B）。表1各組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)和組織學(xué)損傷評(píng)分比較（略）

　　2.4血小板黏附功能、聚集功能的變化

　　造模3 d N組和M的PadT， PagT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 3 wk后，N組和M組的PAdT， PAgT有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），模型組增高；經(jīng)不同干預(yù)，NS組血小板黏附功能、聚集功能明顯增高，而PTX組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05， 表2）。A： 生理鹽水處理組； B： 己酮可可堿處理組。表2大鼠潰瘍性結(jié)腸炎血小板黏附功能、聚集功能及PTX的影響（略）

　　2.5大鼠潰瘍性結(jié)腸炎TXB2， vWF∶Ag及ICAM1含量變化造模3 d M組（3 d）的TXB2， vWF∶Ag及ICAM1含量較N組（3 d）增高；3 wk后，M組3項(xiàng)指標(biāo)的增加量更大，經(jīng)不同干預(yù)，PTX組較NS組明顯降低（表3）。表3大鼠潰瘍性結(jié)腸炎TXB2， vWF∶Ag及ICAM1含量變化及PTX的影響（略）

　　3討論

　　臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者活動(dòng)期腸粘膜呈彌漫性充血水腫，且有出血點(diǎn)，腸系膜血管可出現(xiàn)多灶性的微梗死，發(fā)生血小板栓塞性疾病的概率比正常人高，這可能與患者體內(nèi)血小板處于激活狀態(tài)密切相關(guān)［3］。 傳統(tǒng)上認(rèn)為炎癥與血栓形成是兩個(gè)互相獨(dú)立的病理過(guò)程。 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［4］炎癥與血栓形成之間存在著密切的聯(lián)系，現(xiàn)已公認(rèn)體內(nèi)炎癥凝血之間存在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。 本實(shí)驗(yàn)采用TNBS灌腸造UC模型的方法，造模3 d隨機(jī)處死模型組和正常對(duì)照組大鼠各10只，檢測(cè)大鼠血清血小板黏附率和聚集率，結(jié)果顯示兩組之間無(wú)明顯差異；而檢測(cè)標(biāo)志血小板活化大鼠血清TXB2， vWF∶Ag含量，兩組則有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 UC發(fā)病過(guò)程，血小板不僅參與血栓形成，其作為炎癥細(xì)胞可直接引起炎癥反應(yīng)。 活化的血小板可釋放多種炎癥介質(zhì)，如血栓素、血小板活化因子等。 TXB2， vWF∶Ag含量增高，既標(biāo)志血小板活化，又代表脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。 之所以造模初期血小板黏附率和聚集率無(wú)明顯變化，分析認(rèn)為，可能與造模初期血小板未被完全激活，尚不能影響血小板黏附率和聚集率有關(guān)。

　　本研究應(yīng)用己酮可可堿干預(yù)UC大鼠模型，其作用明顯優(yōu)于生理鹽水模型組，大鼠結(jié)腸大體形態(tài)和組織學(xué)損傷評(píng)分，PTX組和NS組比較有顯著性差異。 己酮可可堿主要作用是抑制血小板聚集，進(jìn)而可減少血小板之間以及血管內(nèi)皮的粘附與聚集，能改善高凝狀態(tài)抑制血栓形成。 同時(shí)抑制血小板活化可減少脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生從而阻止組織細(xì)胞損傷［5-6］。 PTX可以降低中性粒細(xì)胞（PMN）的粘附聚集能力，抑制PMN的膜補(bǔ)體C3受體的表達(dá)，起到免疫抑制作用［7］。 本實(shí)驗(yàn)顯示，己酮可可堿可明顯抑制大鼠血清血小板黏附率和聚集率，降低大鼠血清TXB2，vWF∶Ag和ICAM1含量。 認(rèn)為己酮可可堿可通過(guò)抗凝、抗炎癥介質(zhì)、抗炎癥免疫而達(dá)到治療UC作用。

　　【參考文獻(xiàn)】［1］Webberley MJ， Hart MT， Melikian V. Thromboembolism in inflammatory bowel Disease： Role of platelets［J］。 Gut， 1993，34：247-251.

　　［2］賀國(guó)斌，歐陽(yáng)欽，陳岱云，等。 潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織微血栓形成的研究［J］。中國(guó)內(nèi)鏡雜志，2003，9（7）：34-36.

　?。?］魏艷靜，卞紅磊，武會(huì)珍。潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)血小板功能狀態(tài)研究［J］。 臨床薈萃， 2003，18（11）：608-609.

　?。?］張卉，賀蓉，賀石林。炎癥與血栓形成［J］。 中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84（9）：784-786.

　?。?］崔海宏，陳村龍，王繼德，等。 潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜中趨化因子和核轉(zhuǎn)錄因子的變化［J］。 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（10）：923-925.

　?。?］陳劍鴻，陳韜，劉松青，等。 己酮可可堿對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響［J］。中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（7）：407-409.

　?。?］Coimbra R， Loo W， Melbostad H. LPSStimulated PMN activation and proinflammatory mediator synthesis is downregulated by phosphodiesterase inhibition：Role of pentoxifylline［J］。 J Trauma， 2004， 57（6）：1157-1162.