【關(guān)鍵詞】  分枝桿菌，結(jié)核；Rv2389；基因表達(dá)

　　Construction and expression of eukaryotic  expression vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2389

　　XUE Ying，  BAI YinLan， GAO Hui， WANG LiMei， XU ZhiKai

　　Department of Microbiology， School of Basic Medicine， Fourth Military Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】AIM：  To construct the eukaryotic expression vector encoding Mycobacterium tuberculosis Rv2389 and express it in CHO cells. METHODS： The gene encoding Rv2389 protein were amplified by polymerase chain reaction（PCR）from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain. After sequenced， Rv2389 gene segments were  subcloned into eukaryotic expression vector pCDNA3.1（-）。 The recombinant plasmid pCDNARv2389 were transfected into CHO cells with liposome. The expressions of mRNA and protein encoded by this gene were detected respectively with RTPCR  and  indirect immunofluoresent technology. RESULTS： Rv2389 was cloned into pCDNA3.1（-） correctly， and its expression at mRNA and protein levels was detected in CHO cells. CONCLUSION： Recombinant eukaryotic plasmid encoding Rv2389 was constructed successfully. The experiment established the basis for further study on the function of Rv2389.

　　【Keywords】 mycobacterium tuberculosis； Rv2389； gene expression

　　【摘要】目的：構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因真核表達(dá)載體。 方法：PCR擴(kuò)增Rv2389基因，測(cè)序正確后克隆入真核表達(dá)載體pCDNA3.1（-），重組質(zhì)粒酶切鑒定正確后以陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后， 分別以RTPCR方法檢測(cè)mRNA表達(dá)和間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCDNA Rv2389， RTPCR結(jié)果證明Rv2389可在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光檢測(cè)證明，表達(dá)有Rv2389蛋白的細(xì)胞著染。 結(jié)論：成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因的真核表達(dá)載體pCDNARv2389，Rv2389基因可以在CHO細(xì)胞中表達(dá)。

　　【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌，結(jié)核；Rv2389；基因表達(dá)

　　0引言

　　結(jié)核病是目前危害全球人類(lèi)健康的重要傳染病。 這主要是因?yàn)棰?卡介苗（BCG）對(duì)成年人結(jié)核病的預(yù)防效果不穩(wěn)定，保護(hù)力為0%~70%；② 沒(méi)有特異性的診斷試劑；③ 艾滋病等免疫缺陷個(gè)體的出現(xiàn)加快了本病的嚴(yán)重后果；④ 耐藥菌株的大量出現(xiàn)［1］。 因而尋找更有效的替代卡介苗的疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急。 Rv2389蛋白是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB） 復(fù)活促進(jìn)因子（resuscitationpromoting factor，  Rpf）樣蛋白家族的一員，序列分析發(fā)現(xiàn)，它不僅與細(xì)菌的增殖有關(guān)，還有可能是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的一個(gè)靶抗原［2］。 為此，我們?cè)赗v2389原核表達(dá)和純化的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了真核表達(dá)載體并在CHO（ 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)從其表達(dá)水平和基因轉(zhuǎn)錄兩方面進(jìn)行鑒定，為其功能研究奠定基礎(chǔ)。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　MTB H37Rv菌株，P815細(xì)胞由本室保存；真核表達(dá)載體pCDNA3.1（-）由本室保存；含有Rv2389基因的重組質(zhì)粒pPro EX HTRv2389由本室構(gòu)建保存；Rv2389蛋白多抗由本實(shí)驗(yàn)室制備；AMV，RNA 酶抑制劑和TRIzol（Promega公司）；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶和核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（寶泰克公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）；梭華soft陽(yáng)離子聚合物（廈門(mén)太陽(yáng)馬公司）；羊抗鼠熒光抗體（寶信公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1Rv2389基因片段的擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)核分枝桿菌Rv2389全基因序列的特異性引物序列為：P1：5′gga tcc gcc acc atg acc ccg ggt ttg ctt ac3′，含BamHⅠ酶切位點(diǎn)，起始碼和cozak序列；P2：5′ccg aag ctt atc gtc cct gct ccc cga tga3′，含HindⅢ酶切位點(diǎn)和終止碼。 PCR反應(yīng)條件：94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min. 回收PCR產(chǎn)物，用T4連接酶將PCR產(chǎn)物與pGEMTeasy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，隨機(jī)挑取5個(gè)克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，取2個(gè)鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序［3］。

　　1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將測(cè)序正確的Rv2389基因克隆至真核表達(dá)載體pCDNA3.1（-），構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNARv2389. 連接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取均按文獻(xiàn)進(jìn)行［3］。 以BamHⅠ和HindⅢ酶切pCDNARv2389，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒。

　　1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將5×105 個(gè)CHO細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)量達(dá)孔底約2/3時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染前用不含抗生素的1640培養(yǎng)液洗2次，以0.5 mL 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。 pCDNARv2389重組質(zhì)粒10 μL和陽(yáng)離子聚合物5 μL各用80 μL無(wú)血清的1640培養(yǎng)液稀釋?zhuān)瑑烧呋靹蚝笫覝刈饔?0 min，緩慢加入到細(xì)胞中。  培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。

　　1.2.4RTPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)收集重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，2000 r/min離心10 min. 參照Gibco的TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞mRNA. 在上述10 μL mRNA 溶液中，加入1 μL Oligo（dT）12-18引物，70℃水浴5 min后立即置于冰上，加10×buffer 4 μL， MgSO4 4 μL， 10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA inhibitor 0.6 μL，AMV 0.8 μL，H2O 10.4 μL. 混勻，42℃作用1 h，70℃ 15 min終止反應(yīng)。 PCR反應(yīng)時(shí)加入cDNA第1鏈2 μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸2 min，擴(kuò)增產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

　　1.2.5間接免疫熒光檢測(cè)目的基因表達(dá)將轉(zhuǎn)染pCDNARv2389質(zhì)粒的CHO細(xì)胞爬片，用純化的Rv2389融合蛋白制備的免疫血清作為一抗，間接免疫熒光法檢測(cè)CHO細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)［4］。

　　2結(jié)果

　　2.1目的基因的擴(kuò)增、克隆及酶切鑒定用PCR方法從H37Rv中擴(kuò)增出Rv2389的DNA片段，被順利克隆入pGEMTeasy載體，測(cè)序證實(shí)所克隆的基因完全正確。 序列分析與GenBank報(bào)道的一致（圖1）。

　　M：DL2000 marker；1：PCR產(chǎn)物。

　　圖1Rv2389基因的PCR結(jié)果（略）

　　2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定重組質(zhì)粒pCDNARv2389被BamHⅠ和HindIII 雙酶切后可得到約475 bp的片段，與預(yù)期的大小相一致（圖2）。

　　M：DL2000 marker；  1～3： pCDNARv2389被BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。

　　圖2重組質(zhì)粒的酶切鑒定（略）

　　2.3RTPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)在約475 bp處擴(kuò)增出特異性基因（圖3），表明pCDNARv2389重組質(zhì)?？梢栽贑HO細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。

　　M：DL2000 marker；1：  RTPCR產(chǎn)物。

　　圖3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的RTPCR結(jié)果（略）

　　2.4間接免疫熒光檢測(cè)目的基因表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在經(jīng)過(guò)間接免疫熒光染色后，陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的熒光著染，表達(dá)蛋白定位于細(xì)胞膜上，而對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有著染（圖4）。

　　A：Rv2389融合蛋白在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；B：對(duì)照。

　　圖4間接免疫熒光測(cè)定融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)×400（略）

　　3討論

　　Mukamolova GV等［5］研究發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌（Micrococcus luteus， M. luteus）可分泌一種Rpf，該因子可刺激該菌休眠體復(fù)活和生長(zhǎng)，也可促進(jìn)繁殖體生長(zhǎng)，研究證實(shí)Rpf作用與真核細(xì)胞的細(xì)胞因子相似，具有自我刺激作用又稱(chēng)細(xì)菌因子。 同時(shí)進(jìn)一步研究證實(shí)該因子也可以刺激其他種類(lèi)的高（G+C）%的革蘭陽(yáng)性菌，包括結(jié)核分枝桿菌。 結(jié)核分枝桿菌全基因序列分析表明，其中Rv1884c；Rv2450c，Rv0867c，Rv1009，Rv2389c和基因與M.luteus菌Rpf基因同源，其中4個(gè)基因編碼的蛋白是分泌蛋白，推測(cè)結(jié)核桿菌這些基因編碼的蛋白可能也具有Rpf作用，但尚無(wú)直接證據(jù)［5-6］。 Sassetti等［7］采用大規(guī)模插入突變分析發(fā)現(xiàn)Rpf樣蛋白并不是H37Rv株生長(zhǎng)所必需，而且這5種Rpf樣蛋白在功能上有一定的重疊。 因?yàn)橥蛔僐v1009基因可明顯減緩MTB的生長(zhǎng)速度，提示其在MTB的生長(zhǎng)中可能發(fā)揮著較為重要的作用。 以往研究［8］表明，MTB H37Rv株的幾種Rpf樣蛋白與M.luteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因而這些蛋白（或者這些蛋白中的某個(gè)或某幾個(gè)蛋白）有可能會(huì)被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分。

　　近年來(lái)，國(guó)外在TB新型疫苗或增強(qiáng)BCG免疫效果方面已作了大量的研究工作，并正在進(jìn)行大規(guī)模的候選疫苗篩選工作。 由于結(jié)核分枝桿菌Rpf家族蛋白不僅可以促進(jìn)結(jié)核休眠菌復(fù)活，而且還具有多種生物學(xué)活性如自溶素和/或青霉素結(jié)合蛋白的功能、細(xì)胞學(xué)方面的功能等［9］，此外這幾種Rpf樣蛋白與M.luteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因而這些蛋白（或者這些蛋白中的某個(gè)或某幾個(gè)蛋白）有可能會(huì)被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)赗v2389原核表達(dá)和純化的工作基礎(chǔ)上構(gòu)建了真核表達(dá)載體并在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)從其表達(dá)水平和基因轉(zhuǎn)錄兩方面進(jìn)行鑒定，為其在新型疫苗的應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ)。

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