【關鍵詞】  大鼠，近交系；肝移植；疾病模型，動物；移植物排斥

　　Establishment of acute rejection model of orthotopic liver transplantation in inbred rats

　　LIU JiangWen， TANG Yong，   LI YouPing， ZHAO Na，  LI Qing， CHENG NanSheng， YAN LüNan

　　Department of General Surgery，  Shihezi Peoples Hospital，  Shihezi 832000， China， Transplantation  Immunity Laboratory， Department of General Surgery，  West China  Hospital， Sichuan University， Chengdu 610041， China

　　【Abstract】 AIM：  To establish the orthotopic liver transplantation models in inbred  rats and judge the grades of acute rejection. METHODS： Surgical skills were trained by using closed colony SD and Wistar rats， followed by DA to LEW orthotopic liver transplantation  with Kamadas twocuff technique. The grades of acute rejection were judged by their clinical manifestations and Banff schema. RESULTS： Fifteen models of DA to LEW liver transplantation were established，  the success rate being 86.7%. The causes of death were hemorrhage and thrombosis of suprahepatic and infrahepatic vena cava and obstruction of biliary tract. Ⅰgrade rejection occurred at 3rd day and reached the peak at 7th day after transplantation. Remaining models died of Ⅲ grade rejection besides of postoperative complication within 12 d after transplantation. CONCLUSION：  The acute rejection of DA to LEW orthotopic liver transplantation model is stable and intensive. It can be effectively used to study allograft rejection and tolerance. But it is difficult to establish the kind of orthotopic liver transplantation models in inbred rats because of their own tissue characteristics.

　　【Keywords】 rats， inbred strains；  liver transplantation； disease models， animal； graft rejection

　　【摘要】目的： 探討近交系大鼠原位肝移植模型的建立并判斷排斥反應發(fā)生的強度。 方法： 采用Kamada二袖套法，利用封閉群大鼠SD和Wistar進行建模技能訓練，在此基礎上建立近交系大鼠DA→LEW肝移植模型，根據(jù)臨床表現(xiàn)和Banff標準判斷排斥反應發(fā)生的強度。 結果： 共施行DA→LEW大鼠肝移植模型15例，手術成功率86.7%，死亡原因為肝上下腔靜脈漏血、肝下下腔靜脈血栓、膽道梗阻。 術后第3天開始出現(xiàn)Ⅰ級排斥反應，7 d以后逐漸達到高峰，除術后并發(fā)癥致死外，剩余均在12 d內死于Ⅲ級排斥反應。 結論： DA→LEW為穩(wěn)定、強烈的大鼠肝移植急排模型，是研究肝移植排斥及免疫耐受的理想動物模型。 但近交系大鼠在組織結構上有其自身特點，給建模帶來一定難度。

　　【關鍵詞】 大鼠，近交系；肝移植；疾病模型，動物；移植物排斥

　　0引言

　　肝移植動物模型是探討移植后各種免疫反應發(fā)生機制的前提。 缺乏可靠的供受體遺傳背景資料的移植免疫研究其價值為零［1］。 近交系大鼠具有遺傳背景明確、單一以及生物學特性資料詳細等優(yōu)點，實驗時重復性好，研究結果具有可比性，因此對移植免疫學的研究具有重要價值。 本實驗利用我校動物實驗中心提供的Wistar和SpragueDawley（SD）大鼠，采用Kamada兩袖套法進行建模的基本技能訓練，在此基礎上選擇近交系大鼠Dark Agouti（DA）為供體、Lewis（LEW）為受體，建立急排模型，現(xiàn)報道如下。

　　1材料和方法

　　1.1材料預實驗期使用健康、清潔級Wistar大鼠共52對，SD大鼠20對，由四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物房提供。 此為訓練建模基本技能、積累圍手術期管理經(jīng)驗。 正式實驗時選擇DA大鼠15只為供體，雄性，體質量220~260 g，由哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學二系動物實驗中心提供。 LEW大鼠15只為受體，雄性，體重300~350 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。 以上大鼠飼養(yǎng)條件符合SPF標準。 供體食水不限，受體術前禁食12 h，自配糖水隨意飲用。

　　上海手術器械廠產SSW3型顯微外科手術器械一套，門靜脈和肝下下腔靜脈袖套用聚乙烯塑料管根據(jù)需要拉制而成，膽道內支撐管用一次性麻醉硬膜外導管制成。 供肝灌洗液為9 g/L生理鹽水500 mL+肝素鈉1支，供肝保存液為乳酸林格氏液500 mL+肝素鈉1支+氨芐青霉素6.0 g . 自制雙層供肝保存容器，內、外層間置冰塊。 清潔級手術，在二級動物實驗室由雙人裸眼完成。

　　1.2方法

　　1.2.1供體手術乙醚持續(xù)吸入麻醉，麻醉前30 min肌注阿托品0.05 mg. 取劍突至恥骨上方腹部正中切口入腹，右側腰靜脈注入含有50 U肝素的生理鹽水2 mL，使供體血液肝素化，逆時針方向游離肝臟。 結扎并切斷右腎動脈、右腎靜脈，結扎右腎上腺靜脈。 游離膽總管下段，剪開其前壁， 插入膽道內支撐管2 mm，橫斷膽總管。游離肝固有動脈，預置線暫不結扎。 結扎切斷胃十二指腸動脈、胃幽門靜脈， 向下游離門靜脈至脾靜脈水平。顯露腹主動脈，4號小兒頭皮針穿刺其近端并固定。 于左腎靜脈平面處剪斷肝下下腔靜脈作為流出道。 快速剪開膈肌，阻斷胸主動脈，以低于3 mL/min的速度緩慢注入4℃ 供肝灌洗液20 mL. 灌注的同時用4℃生理鹽水反復澆淋肝臟表面，當肝臟變?yōu)榫鶆蛲咙S色時結束灌注（圖1）。 取下肝臟，置于4℃供肝保存液中待用。

　　圖1經(jīng)腹主動脈供肝雙重灌注（略）

　　1.2.2修肝供肝修整在4℃保存液中進行。 先安裝門靜脈袖套，完成后，立即經(jīng)門靜脈低壓注入2~3 mL供肝灌洗液，觀察套管是否通暢并排出肝臟內的殘留積血（圖2）。 同法安裝肝下下腔靜脈袖套并檢查通暢情況。 最后修整肝上下腔靜脈。 更換供肝保存液，液面過肝，將供肝置于4℃冰箱中待用。 供肝保存時間在1~1.5 h.

　　1.2.3切除受體肝臟麻醉前30 min肌注阿托品0.05 mg，麻醉方式、開腹及暴露同供體手術。 用一溫熱生理鹽水紗布覆蓋腸管并將其推向左下腹腔，游離肝臟基本同供肝操作。 游離肝上下腔靜脈后壁，套入一根橡皮筋備用。 在右腎靜脈平面以上游離肝下下腔靜脈。 結扎右腎上腺靜脈。 結扎切斷肝固有動脈，保留胃十二指腸動脈。 游離膽總管近端，于左右肝管匯合部向遠端預插一支撐管以擴張備用，貼近肝臟剪斷膽管各分支。 分離門靜脈左右支，分別套過一根50絲線，暫不結扎。 于右腎靜脈水平上方阻斷肝下下腔靜脈，在幽門靜脈上方阻斷門靜脈，開始無肝期。 停止乙醚吸入。 以4號小兒頭皮針穿刺門靜脈分叉部，向肝內緩慢注入2 mL常溫生理鹽水至肝臟變白（圖3）。 立即牽引肝上下腔靜脈后方的橡皮筋以防止血液倒流，以Satinsky鉗連同部分膈肌一起阻斷肝上下腔靜脈。 結扎門靜脈左右分支，緊貼肝臟切斷肝上下腔靜脈、門靜脈左右支、肝下下腔靜脈，移除受者自身肝臟。

　　圖2供肝門靜脈袖套安裝后再灌注（略）

　　圖3受體門靜脈阻斷后自身輸血（略）

　　1.2.4原位肝臟移植將供肝原位置入受體右上腹，注意各肝葉勿發(fā)生扭曲。 吻合過程中，肝臟表面敷以4℃的生理鹽水紗布以保持供肝的低溫狀態(tài)。 ① 吻合肝上下腔靜脈：采用一根縫線連續(xù)縫合法，從左至右連續(xù)縫合后壁，至右側角時最后一針扣鎖縫合將縫線拉緊（圖4），然后繼續(xù)從右至左連續(xù)縫合前壁，至左側角時與尾線打結。 在打結前沖出肝上下腔靜脈管腔內的氣泡，以免形成氣栓。 ② 排除門靜脈管腔內的積血，將供肝門靜脈袖套套入受體門靜脈內。 開放門靜脈，結束無肝期。 可見肝臟迅速變紅，腸管淤血迅速消失。 ③ 將供肝肝下下腔靜脈袖套置入受體肝下下腔靜脈內，恢復體循環(huán)血流。 可見腎臟顏色迅速恢復正常。 以37℃溫鹽水沖洗腹腔，重點是肝臟周圍，及時復溫。 ④ 膽總管連接：拔除受體膽總管內的支撐管，將供體膽總管內預置管的另一端插入受體膽總管內并固定。 大網(wǎng)膜覆蓋膽總管吻合口處。 檢查腹腔內無出血，向腹腔內注入含氨芐青霉素50 mg的生理鹽水1 mL，單層關腹。 經(jīng)陰莖背靜脈補充乳酸林格氏液1 mL，術畢。

　　圖4良好的暴露有利于SVC后壁的縫合（略）

　　1.2.5術后處理大鼠單籠飼養(yǎng)，燈照保暖直至大鼠完全清醒。 術后2 h恢復飲水，給予100 g/L葡萄糖水。 術后24 h恢復進食。 不給任何免疫抑制劑。 死亡大鼠及時尸檢。

　　1.3觀察指標觀察受體術后精神狀態(tài)、飲食、活動情況、黃疸、生存時間，未活過48 h者視為手術所致。 分別于術后3 d， 7 d 隨機活殺大鼠2只，取肝臟組織40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色。 觀察移植肝病理變化，對匯管區(qū)炎癥、膽管炎癥、靜脈內皮炎癥進行RAI（rejection activity index）計分，最后總評。 剩余觀察生存時間，死前取肝組織標本。 急性排斥反應的診斷參照1997年制定的Banff 國際標準。

　　2結果

　　2.1近交系大鼠建模情況采用改進的二袖套法進行15例近交系大鼠原位肝移植，供體手術時間（46±4） min，修肝時間（24±2） min，受體無肝期（23±5） min，肝上下腔靜脈縫合時間（13±2） min，門靜脈套管時間（3±2） min，肝下下腔靜脈套管時間（3±2） min，膽道重建時間（2±1） min，受體總手術時間（65±5）min.

　　2.2術后臨床表現(xiàn)及生存情況本組48 h內死亡2例，1例死于肝上下腔靜脈吻合口漏血，1例死于肝下下腔靜脈血栓，手術成功率為 86.7%. 1 wk內死亡2例，死亡原因均為肝下下腔靜脈血栓，1 wk生存率為73.3%. 分別于術后3 d， 7 d隨機活殺大鼠2只，取肝臟組織做病檢。 剩余7只觀察存活時間。 受體大鼠術后1 d精神尚可，進食水量下降，反應稍遲鈍。 術后5~7 d大鼠開始出現(xiàn)黃疸，精神狀況變差，警覺性下降，食量明顯減少。 術后10 d黃疸加重，較前明顯消瘦，小便深黃，大鼠皮毛蓬松而雜亂，神萎而不愿活動，對外界刺激反應遲鈍。 術后9 d死亡1例，10 d死亡2例，11 d死亡1例，12 d死亡3例。 10 d 1只死因為膽道梗阻，尸體解剖見腹腔內有腹水，膽管梗阻、擴張，內有膽泥形成（圖5），病理切片證實有較明顯的肝內膽管擴張，其余6只均死于排斥反應。

　　圖5術后10 d死于膽道梗阻，尸檢見膽道擴張、膽泥形成（略）

　　2.3移植肝排斥反應判定術后3 d出現(xiàn)輕度匯管區(qū)混合淋巴細胞浸潤，少量膽管炎性細胞浸潤，為0~Ⅰ級排斥反應（RAI評分2~3分）。 7 d排斥反應迅速發(fā)展，匯管區(qū)淋巴細胞浸潤明顯，其旁的肝組織有反應性病灶，呈橢圓形或三角形，伴大量細胞浸潤，以單核細胞和淋巴細胞為主。 小葉間動脈、靜脈未見明顯壞死，小葉間膽管大部分正常，偶見擴張，判為Ⅱ~Ⅲ級排斥反應（RAI評分7分）。 死于術后9~12 d的6只均為Ⅲ級排斥反應（RAI評分平均9分）。 病理學主要表現(xiàn)為：大多數(shù)匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，并浸及匯管區(qū)周圍的肝實質中，匯管區(qū)明顯增寬。 多數(shù)小膽管上皮有炎性細胞浸潤，可見膽管退行性改變或膽管結構不完整。 小葉間靜脈和（或）中央靜脈內皮下有淋巴細胞浸潤，伴明顯的靜脈周圍炎，肝實質細胞局灶性壞死或橋接壞死。 （圖6~8）。

　　圖6術后3 d，匯管區(qū)少量淋巴細胞浸潤，部分膽管炎性損傷，Ⅰ級排斥HE ×400（略）

　　圖7術后7 d，匯管區(qū)增寬，較多淋巴細胞浸潤，明顯的膽管炎性損傷和靜脈內皮炎，Ⅱ～Ⅲ級排斥HE ×400（略）

　　圖8術后12 d，匯管區(qū)顯著增寬，大量淋巴細胞浸潤，明顯的膽管炎性損傷和靜脈內皮炎，Ⅲ級排斥HE ×400（略）

　　3討論

　　目前國際上涉及大鼠肝移植免疫反應的研究均采用近交系，有較多的排斥模型可供選擇，如DA→AUG， LEW→AUG， DA→LEW， LEW→BrownNorway等［2］，國內僅有個別學者建立了F344和LOU/CN 近交系大鼠的肝移植模型［3］。 而封閉群大鼠如SD和Wistar僅用于研究缺血再灌注損傷等。 但國內由于嚴重缺乏近交系大鼠，所以大多數(shù)報道仍用Wistar→SD或SD→Wistar建立急排模型［4-5］。 但有研究認為，SD與Wistar大鼠為封閉群大鼠，有一定的遺傳穩(wěn)定性，同時也具有一定的基因多態(tài)性，Wistar與SD大鼠的肝移植模型可能不是研究大鼠肝移植急性排斥反應的理想模型［6］。

　　本實驗采用近交系DA， LEW兩個不同品系的大鼠建立大鼠原位肝移植的動物模型，結果顯示急性排斥反應于移植術后3 d開始發(fā)生，7 d 以后發(fā)展迅速，并導致大鼠12 d 內全部死亡。 急性排斥反應的診斷應以臨床特征、形態(tài)學異常為依據(jù)，更以組織學特征為“金標準”。 本實驗有多于50%的膽管炎性損傷和門靜脈、中央靜脈周圍炎，符合急性排斥反應的診斷標準。

　　3.1近交系大鼠與封閉群大鼠在建模時的不同之處與封閉群大鼠SD和Wistar相比，我們感受近交系大鼠DA和LEW在建模時有以下不同： ① DA大鼠肝臟顆粒較粗大，顏色偏深偏暗，經(jīng)腹主動脈灌注后，不似SD和Wistar大鼠那樣，肝臟呈細嫩土黃色，而是土黃色偏暗紅；② 15例DA大鼠肝下下腔靜脈旁結締組織內均有黃褐色脂肪沉積，致使下腔靜脈管腔狹小、管壁彈性差，給袖套安裝帶來困難，甚至要用和門靜脈袖套規(guī)格相似的套管安裝。將窄小的袖套置入受體肝下下腔靜脈時，若受鼠肝下下腔靜脈管徑較大，這將會造成下腔靜脈通而不暢，影響其血液回流，為術后發(fā)生血栓留下隱患。 所以供受體體重的要求比較重要，受鼠體重最好與供鼠相仿或不超過供鼠10%為好，以求其肝下下腔靜脈管徑較為接近。 本組因術后并發(fā)癥死亡4例，3例是因為肝下下腔靜脈血栓所致。 這和我們沒有嚴格要求供受體質量有直接關系（受體≥供體100 g），此當引以為訓。 而DA大鼠此種血管周圍變化是否為近親繁殖所致，有待于進一步考證。 ③ 近交系大鼠屬SPF（specific pathogen free）動物，飼養(yǎng)環(huán)境及飲食管理較為嚴格，我們將其放置在有屏障系統(tǒng)的實驗室內飼養(yǎng)，以確保大鼠健康，實驗數(shù)據(jù)可靠。

　　3.2手術操作技巧及改進

　　3.2.1乙醚劑量應量化乙醚易揮發(fā)，具有起效快、失效快、效果確切、無肝期可以完全撤除、肝臟毒性小的特點。 但由于沒有固定的麻醉劑量可供參考，所以，適當?shù)穆樽韯┝恐挥型ㄟ^反復的實踐才能摸索出來。 我們感覺體質量在250~300 g的大鼠給予8~10 mL的乙醚吸入，便可保證整個手術的順利進行。 還需注意的就是因大鼠個體差異而調整麻醉筒的距離。 麻醉應“深誘導、淺維持”，我們的體會是在開始時給予較大劑量的乙醚吸入，而手術中以較低濃度維持，根據(jù)麻醉情況調整麻醉筒距離，取得良好效果。 忌時吸時停，這必然導致麻醉不平穩(wěn)。

　　3.2.2經(jīng)腹主動脈雙重灌注供肝供肝灌注的好壞直接影響手術成敗。 在模型訓練前期，我們均采用門靜脈灌注，但發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)不理想，供肝有大小不等的“盲區(qū)”存在。 查閱文獻后［7］，后期我們改用經(jīng)腹主動脈灌注，灌注液部分經(jīng)肝動脈直接灌注肝臟，大部分經(jīng)內臟器官循環(huán)后進入門靜脈灌注肝臟，使肝臟得到雙重灌注，而且易保持門靜脈壓力適當。 此時獲取的供肝質地柔軟、呈均勻土黃色，基本無“盲區(qū)”存在。 我們體會：經(jīng)腹主動脈肝臟灌注較傳統(tǒng)經(jīng)門靜脈灌注，灌洗更均勻、更徹底，在灌注同時用0~4℃生理鹽水噴灑肝臟表面，使供肝迅速進入冷缺血狀態(tài)。 以上措施的應用，可確保我們獲取一個熱缺血時間接近于零、質量良好的供肝（圖1）。

　　3.3.3供肝再灌洗我們先完成門靜脈袖套的安裝，然后立即經(jīng)門靜脈袖套注入2~3 mL 4℃供肝灌洗液，一為檢測袖套是否通暢，二為盡快沖出供肝內殘留積血。 經(jīng)供肝再灌洗后，往往可排出含有大量紅細胞的肝內積血。此舉有助于提高供肝質量 （圖2）。

　　3.3.4肝上下腔靜脈吻合技巧肝上下腔靜脈吻合是整個手術的最難點。 良好的暴露是進行肝上下腔靜脈吻合的先決條件。 必須做到在直視下縫合每一針，才能保證縫合均勻，不重針、不漏針。 除用兩側的小拉鉤拉開腹壁及肋弓、用橡皮筋將劍突向頭側牽引外，可在大鼠背部墊一直徑約1cm的圓柱形腰枕協(xié)助暴露。 將供肝腔靜脈前壁用80血管線縫合一針，吻合時將其牽開，可清晰暴露腔靜脈后壁（圖4），使吻合難度大大降低。 采用一根縫線連續(xù)縫合法，從左至右連續(xù)縫合后壁，至右側角時最后一針扣鎖縫合將縫線拉緊，然后繼續(xù)從右至左連續(xù)縫合前壁，至左側角時與尾線打結。 本方法具有縫合速度快，效果肯定的優(yōu)點，可有效地縮短縫合時間和無肝期。

　　3.3.5受體自身輸血受體術中出血總量超過2 mL，一般術后極難存活。 我們在受體肝臟切除前阻斷門靜脈，在其分叉處下方穿刺，推注生理鹽水2 mL致肝臟變?yōu)橥咙S色，可驅使1～2 mL肝內血進入血循環(huán)（圖3）。 然后立即阻斷肝上下腔靜脈，以防倒流，這相當于自身輸血。 此舉可補充血容量，增加受體對手術的耐受性。

　　DA→LEW是一組穩(wěn)定、強烈的肝移植急排模型，將會在肝臟移植免疫的基礎研究中發(fā)揮作用。 近交系大鼠對手術耐受性較差，建模難度較大，要求也更高。 并且由于其本身近交特性，可能會在組織結構上發(fā)生異常，也給實驗帶來了一些意想不到的情況，今后在建立近交系大鼠肝移植模型時應引起注意。

　　【參考文獻】

　?。?］ 陳忠華。在體移植免疫實驗研究應注意的幾個問題［J］。 中華器官移植雜志，2002；23：4-5.

　?。?］Yamamoto S， Okuda T， Yamasaki K， et al. FK778 and FK506 combination therapy to control acute rejection after rat liver allotransplantation［J］。 Transplantation， 2004，78（11）：1618-1625.

　?。?］ 管文賢，陳勇。 器官移植的動物實驗技術［A］//施新猷。現(xiàn)代醫(yī)學實驗動物學［M］。 北京： 人民軍醫(yī)出版社，2000：411-430.

　?。?］ Jiang GP， Hu ZH， Zheng SS， et al. Adenovirus mediated CTLA4Ig gene inhibits infiltration of immune cells and cell apoptosis in rats after liver transplantation［J］。 World J Gastroenterol， 2005 ；11（7）： 1065-1069.

　　［5］ Jia C， Zheng S， Zhu Y. Intrathymic inoculation of liver specific antigen alleviates liver transplant rejection［J］。 Chin Med Sci J， 2004，19（1）：38-43.

　?。?］劉靜，高毅，汪爽，等。 引起排斥反應模型肝移植大鼠生存時間延長分析［J］。 廣東醫(yī)學，2004，25（12）：1374-1376.

　　［7］李宗狂，馬毅，許赤，等。 大鼠原位肝移植模型的建立及術式改進［J］。 中國修復重建外科雜志，2004；18（1）： 34-36.