【摘要】  共納入80只無特定病原體級(jí)大鼠，將60只造成結(jié)腸慢輸型便秘模型，并隨機(jī)分為模型組、西沙比利組和益氣開秘方組（簡(jiǎn)稱中藥組），其余20只設(shè)為正常對(duì)照組。以碳末推進(jìn)百分率、離體腸肌條收縮頻率及振幅、一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase-1， NOS1）和P物質(zhì)為觀察指標(biāo)。結(jié)果：模型組的碳末推進(jìn)百分率較正常對(duì)照組明顯降低（ P <0.05），中藥組和西沙比利組均明顯高于模型組 （ P <0.05） .模型組與正常對(duì)照組相比，其各腸段腸肌條收縮的頻率和振幅明顯降低，中藥組和西沙比利組與模型組比較均有提高（ P <0.05）。模型組結(jié)腸腸壁組織NOS1陽性細(xì)胞面積百分比明顯高于正常對(duì)照組、西沙必利組和中藥組，中藥組與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）。模型組P物質(zhì)陽性細(xì)胞面積百分比較正常對(duì)照組明顯下降，中藥組與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）。結(jié)論：益氣開秘方可通過提高大鼠腸道平滑肌收縮的頻率和振幅來促進(jìn)腸道動(dòng)力。其作用途徑與調(diào)控腸神經(jīng)叢NOS1和P物質(zhì)陽性表達(dá)有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  結(jié)腸疾病， 功能性

　　結(jié)腸慢輸型便秘（slow transit constipation， STC）是由于胃腸道傳輸功能障礙所致的便秘，其相關(guān)發(fā)病因素眾多，但確切發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年我科以恢復(fù)胃腸傳導(dǎo)功能為治療原則，將益氣開秘方應(yīng)用于結(jié)腸慢輸型便秘的臨床治療，取得了滿意效果。本課題旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)益氣開秘法對(duì)腸道運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用，并主要從腸道神經(jīng)肽P物質(zhì)（substance P， SP）和一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase-1， NOS1）的角度探討其作用機(jī)制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 動(dòng)物來源與品系 實(shí)驗(yàn)用無特定病原體級(jí)（specific pathogen free， SPF）SD大鼠80只（中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g.

　　1.1.2 藥物 益氣開秘方由生黃芪30 g、生白術(shù)15 g、枳殼12 g、杏仁12 g、生地黃15 g、火麻仁15 g組成，由龍華醫(yī)院制劑室按2000年版藥典要求，制備成水煎劑，約含生藥量2 g/ml. 根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》［1］計(jì)算出中藥人鼠等效劑量，2 ml/次， 2次/d 灌胃。西安楊森制藥廠生產(chǎn)的西沙必利（普瑞博思）為對(duì)照藥物，規(guī)格為5 mg/片。用生理鹽水溶解至約含藥量0.05 mg/ml，根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》［1］計(jì)算人鼠等效劑量，2 ml/次，2次/d灌胃。

　　1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 臺(tái)氏液（每1 000 ml中含NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、CaCl20.2 g、NaHCO31.0 g 、NaH2PO40.05 g、MgCl20.1 g、葡萄糖1.0 g）、武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的工作濃度均為1∶80的NOS1兔抗多克隆抗體和P物質(zhì)兔抗多克隆抗體、SABC型免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒和CW-3型平滑肌槽以及Olympus公司生產(chǎn)的AHBT-5B通用研究顯微鏡。

　　1.2 造模方法 參考文獻(xiàn)［2］用口服復(fù)方苯乙哌啶加酚酞的方法建立大鼠結(jié)腸慢輸型便秘模型。飼喂3個(gè)月造模成功后分組給藥。

　　1.3 動(dòng)物分組及取材

　　1.3.1 動(dòng)物分組 采用完全隨機(jī)方法分為模型組、西沙必利對(duì)照組和中藥組，另設(shè)正常對(duì)照組。每組各20只大鼠。分組當(dāng)日起給藥，連續(xù)給藥4周后取 材。

　　1.3.2 取材 實(shí)驗(yàn)前24 h將大鼠禁食不禁水。每組各取10只，實(shí)驗(yàn)前1 h用100 g/L活性碳混懸液1 ml灌胃，灌胃1 h后脫頸處死，立即剖腹，取出從幽門到直腸末端的全部腸道，在松弛狀態(tài)下測(cè)量腸道的全長(zhǎng)及活性碳在腸道內(nèi)推進(jìn)的長(zhǎng)度，計(jì)算推進(jìn)百分率。每組另10只大鼠，動(dòng)脈放血處死，腹正中切口進(jìn)腹，快速于回盲部、升結(jié)腸及降結(jié)腸中部各取一段腸管，約2 cm長(zhǎng)，置于臺(tái)式液（pH 6.6～6.8）平皿中沖洗干凈，縱行剖開腸管，剝?nèi)ヰつ?，去除附著的系膜或脂肪，放在充氧、保溫?7 ℃左右）的臺(tái)氏液中備用。在橫結(jié)腸部位取新鮮腸壁組織，放于10%中性甲醛固定液中，用于形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化實(shí)驗(yàn)。

　　1.4 觀察指標(biāo)與方法

　　1.4.1 活性碳推進(jìn)試驗(yàn)檢測(cè)腸道傳輸功能 碳末推進(jìn)百分率（%）=（碳末前端與幽門的距離/腸道全長(zhǎng)）×100

　　1.4.2 離體腸肌條動(dòng)力測(cè)定 將放在充氧、保溫（37 ℃左右）的臺(tái)氏液中的肌條，一端固定在CW-3型平滑肌槽下端的彎鉤，另一端固定于拉力換能器（量程10 g）。肌條放入含有持續(xù)充氧的臺(tái)氏液容器中，待自發(fā)活動(dòng)穩(wěn)定后，描記正常曲線3 min，張力變化通過多道生理記錄儀記錄到微機(jī)，以Chart 4.0軟件分析記錄，統(tǒng)計(jì)肌條收縮的振幅及頻率。

　　1.4.3 免疫組化法檢測(cè)NOS1和P物質(zhì)的表達(dá) 免疫組化SABC法檢測(cè)NOS1和P物質(zhì)表達(dá)，具體方法按試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察，有棕黃染色者為NOS1和P物質(zhì)陽性。采用德國(guó)Leica（萊卡）全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，對(duì)各組免疫組化切片進(jìn)行圖像分析。根據(jù)各組切片中的染色條件，在統(tǒng)一閾值下進(jìn)行。在200倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，測(cè)定各組在統(tǒng)一光度下陽性細(xì)胞的陽性面積百分比。

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SSPS 11.5軟件，碳末推進(jìn)百分率、腸管肌條收縮的振幅及頻率、NOS1和P物質(zhì)陽性細(xì)胞的積分光密度均采用方差分析的方法作組間差異的比較。

　　2 結(jié)果

　　2.1 腸道碳末推進(jìn)試驗(yàn)檢測(cè)碳末推進(jìn)百分率 模型組較正常對(duì)照組明顯降低，中藥組和西沙比利組較模型組均明顯提高，中藥組與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1.

　　表1 各組碳末推進(jìn)百分率的比較（略）

　　Table 1 Comparison of percentage of carbon propelling in 4 groups

　　*P <0.05 vs untreated group；△P <0.05 vs normal control group.

　　2.2 離體腸管肌條收縮活動(dòng) 模型組各腸段腸管肌條收縮的頻率和振幅較正常對(duì)照組明顯降低。中藥組和西沙比利組與模型組比較，頻率和收縮振幅均有提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥組和西沙比利組的升結(jié)腸段腸管肌條收縮的頻率和振幅與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2和圖1.

　　表2 各組腸收縮頻率和振幅的比較（略）

　　Table 2 Comparison of contraction frequency and amplitude of the muscle segments in 4 groups

　　* P <0.05 vs untreated group；△P <0.05 vs normal control group.

　　圖1 升結(jié)腸平滑肌條收縮頻率及振幅（略）

　　Figure 1 Contraction frequency and amplitude of smooth muscle segment of ascending colon of the rats in 4 groups A： Normal control group； B： Untreated group； C： YQKMR treated-group； D： Cisapride treated-group.

　　2.3 結(jié)腸腸壁組織NOS1和P物質(zhì)表達(dá) 正常大鼠結(jié)腸腸壁組織內(nèi)P物質(zhì)陽性神經(jīng)元密集分布，胞體較大，而模型組P物質(zhì)陽性神經(jīng)元分布分散稀疏，胞體較小。正常對(duì)照組NOS1陽性神經(jīng)元分布稀疏，而模型組NOS1陽性神經(jīng)元分布明顯增多。圖像分析顯示NOS1陽性細(xì)胞面積百分比， 模型組較正常對(duì)照組、西沙必利組和中藥組明顯升高，中藥組NOS1陽性細(xì)胞面積百分比與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P物質(zhì)陽性細(xì)胞面積百分比，模型組較正常對(duì)照組明顯下降，其中中藥組P物質(zhì)陽性細(xì)胞面積百分比與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3、圖2和圖3.

　　表3 大鼠腸壁組織NOS1和P物質(zhì)陽性面積（略）

　　Table 3 Expressions of NOS1 and SP in colon wall tissue of the rats in 4 groups

　　*P <0.05 vs untreated group；△P <0.05 vs normal control group.

　　圖2 大鼠結(jié)腸組織NOS1陽性表達(dá)（SABC，10×10）（略）

　　Figure 2 Expression of NOS1 protein in colon wall tissue of the rats （SABC，10×10）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： YQKMR treated-group； D： Cisapride treated-group.

　　圖3 大鼠結(jié)腸組織P物質(zhì)陽性表達(dá)（SABC，10×20）（略）

　　Figure 3 Expression of SP in colon wall tissue of the rats （SABC，10×20）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： YQKMR treated-group； D： Cisapride treated-group.

　　3 討論

　　結(jié)腸慢輸型便秘屬中醫(yī)學(xué)“陰陽結(jié)”、“脾約”等范疇。我們根據(jù)中醫(yī)學(xué)“陰陽結(jié)”、“脾約”的理論認(rèn)識(shí)并結(jié)合本單位便秘?？?0余年的臨床實(shí)踐，提出氣化不利、氣機(jī)郁滯和氣虛津虧是本病的病機(jī)。針對(duì)其病機(jī)，我們認(rèn)為益氣開秘是恢復(fù)胃腸傳導(dǎo)功能的關(guān)鍵。補(bǔ)益中氣是直接動(dòng)力，調(diào)暢氣機(jī)是間接動(dòng)力。若氣得補(bǔ)養(yǎng)，以復(fù)其剛大之性，則沖突排蕩，開秘行滯。此外，通過補(bǔ)氣、升清降濁和蒸化津液可達(dá)補(bǔ)陰目的。益氣開秘方中以生黃芪和生白術(shù)為君藥，枳殼、杏仁理氣開秘以開上竅，通下竅，促進(jìn)大腸傳導(dǎo)功能，少佐以生地以助濡養(yǎng)腸道。 碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)顯示模型組碳末推進(jìn)百分率較正常對(duì)照組明顯降低，中藥組和西沙比利組與模型組比較，碳末推進(jìn)百分率均明顯提高，說明中藥有一定促進(jìn)腸道動(dòng)力作用。離體肌條收縮試驗(yàn)顯示模型組肌條收縮頻率和振幅較正常對(duì)照組明顯下降，中藥組肌條收縮頻率和振幅與模型組比較均有明顯提高，其中對(duì)于升結(jié)腸段振幅的恢復(fù)最為明顯，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腸道動(dòng)力是由多種神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體構(gòu)成的復(fù)雜神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控。其中一氧化氮（nitric oxide， NO）是主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)叢內(nèi)的NOS1神經(jīng)元通過釋放NO而抑制結(jié)腸推 進(jìn)性收縮。研究表明STC患者結(jié)腸壁肌間叢和黏膜下叢NOS1表達(dá)均增高，從而釋放大量的NO，導(dǎo)致結(jié)腸推進(jìn)性收縮受抑制［3］。SP神經(jīng)元屬于肽能神經(jīng)元，SP是刺激腸道運(yùn)動(dòng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。STC患者結(jié)腸壁肌間神經(jīng)叢SP能神經(jīng)元減少或功能降低［4～6］。童衛(wèi)東等［7］應(yīng)用NOS1和SP的兔多克隆抗體，對(duì)手術(shù)切除的15例STC患者和 11例 對(duì)照組乙狀結(jié)腸慢輸型便秘患者標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色和半定量分析，結(jié)果STC患者乙狀結(jié)腸肌間神經(jīng)叢NOS1免疫反應(yīng)性明顯升高，而SP免疫反應(yīng)性明顯降低。黏膜下神經(jīng)叢NOS1及SP免疫反應(yīng)性與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為STC結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)NOS1和SP免疫反應(yīng)性的異常變化可能是其結(jié)腸傳輸減慢的神經(jīng)病理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示正常大鼠結(jié)腸腸壁組織內(nèi)SP陽性神經(jīng)元密集分布，胞體較大，而模型組SP陽性神經(jīng)元分布稀疏，胞體較小。正常對(duì)照組NOS1陽性神經(jīng)元分布稀疏，而模型組NOS1陽性神經(jīng)元分布較正常對(duì)照組明顯增多。研究結(jié)果表明本次實(shí)驗(yàn)所采用的大鼠STC病理模型可以反映出NOS1和SP在STC發(fā)生過程中的病理變化。研究進(jìn)一步顯示中藥組和西沙必利組NOS1陽性細(xì)胞面積百分比較模型組明顯降低，其中中藥組NOS1陽性表達(dá)與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而中藥組和西沙必利組SP陽性細(xì)胞面積百分比較模型組均明顯升高，其中中藥組SP陽性表達(dá)與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果均表明益氣開秘方促進(jìn)腸道動(dòng)力的作用可能與上調(diào)SP的陽性表達(dá)和抑制NOS1的陽性表達(dá)有關(guān)，并通過調(diào)控腸道動(dòng)力網(wǎng)絡(luò)中的興奮和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡來達(dá)到恢復(fù)腸道自然生理功能的目的。

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