【摘要】  目的：制備人Lrp蛋白多克隆抗體。 方法：克隆全長lrpcDNA編碼序列并進行原核表達與鑒定。 用鎳離子螯合柱（NiNTA）純化原核表達的全長Lrp蛋白，獲得純度較高的目的蛋白。 用純化后蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體并吸附去除非特異性反應成分。 結(jié)果：Western印跡結(jié)果表明，純化前后的抗血清在69 ku處均檢測到目的蛋白條帶，說明吸附純化后的抗體可以與Lrp蛋白特異結(jié)合。 而純化后抗體Western印跡結(jié)果目的條帶只有一條，說明吸附純化后得到高特異性抗血清，其免疫印跡的效價在10-6以上，有較高免疫印跡滴度。 結(jié)論：成功制備了高效價高特異性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗體，為Lrp功能的進一步研究提供了重要的實驗工具。

　　【關(guān)鍵詞】  脂多糖類

　　0.引言

　　脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）是細菌內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性（G-）細菌感染的主要致病因子，它與某些炎癥的發(fā)生密切相關(guān)［1］。 探討脂多糖刺激后表達發(fā)生改變的基因的功能，有針對性地研究其在LPS信號轉(zhuǎn)導通路中的作用部位及作用性質(zhì)，有助于增加對炎癥反應分子機制的認識。 人lrp（lipopolysaccharide responsed gene， lrp）是一種脂多糖應答基因。 系本課題組采用基于PCR的改良消減雜交技術(shù)，從LPS刺激后的人牙髓細胞差異表達基因文庫中篩選出的應答基因［2］，GenBank錄入號為AF143740. 但當時得到的只是該基因編碼N端186個氨基酸的序列。 隨后全長cDNA也被克隆并錄入GenBank（錄入號NM018360）。 本課題組克隆了全長lrpcDNA編碼序列并進行了原核表達與鑒定［3］。 分析表明，全長人lrp編碼528個氨基酸，并有亮氨酸拉鏈的特征結(jié)構(gòu)。 本實驗對原核表達的Lrp蛋白進行純化，用純化后的蛋白免疫新西蘭大白兔制備抗血清。

　　1.材料和方法

　　1.1材料大腸桿菌BL21（DE3）由本室保存；重組人lrp 融合表達載體pcTAThlrp由本課題組構(gòu)建保存。 LPS（Sigma公司）；HRP標記的羊抗兔IgG及化學發(fā)光底物（Pierce公司）；弗氏完全、不完全佐劑（GibcoBRL公司）；NiNTA純化系統(tǒng)（Qiagen公司）；純種新西蘭大白兔（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心）。

　　1.2方法

　　1.2.1Lrp的表達純化將重組人lrp融合表達載體pcTAThlrp轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細菌，挑單菌落擴大培養(yǎng)后IPTG（終濃度為0.2 mmol/L）誘導表達6HisTATLrp融合蛋白。 將誘導后的菌液2292 g/min離心10 min，收集菌體，用STE （100 g/L蔗糖， 10 mmol/L TrisCl pH 8.0， 1 mmol/L EDTA pH 8.0）洗1遍；離心收集菌體后用STE重懸，超聲破碎菌體（整個過程均在冰浴中），13 201 g，4℃，離心30 min，收集包涵體沉淀，再用包涵體溶解緩沖液（50 mmol/L TrisCl pH 8.0， 1 mmol/L EDTA pH 8.0， 100 mmol/L NaCl， 8 mol/L尿素）溶解沉淀，13 201 g/min，4℃，離心30 min，收集上清；用鎳離子金屬螯合柱（NiNTA）純化Lrp蛋白（按公司提供的操作說明進行），并作SDSPAGE分析。

　　1.2.2抗體制備用約40 μg純化的Lrp蛋白于脊柱兩側(cè)多點注射免疫新西蘭大白兔，免疫周期為0 d， 7 d， 28 d， 35 d. 第1次加弗氏完全佐劑，其余3次加弗氏不完全佐劑。 第4次免疫1 wk后頸動脈取血，37℃靜置12 h分離血清，1467 g/min 離心10 min去除殘留紅細胞。 將制備的抗血清按1∶104稀釋，以免疫前兔血清為對照對誘導表達Lrp后的全菌蛋白樣品進進行Western Blot分析檢測抗體。

　　1.2.3抗Lrp抗血清的吸附純化和特異性鑒定培養(yǎng)轉(zhuǎn)化pcTAT載體的BL21（DE3），收菌后用STE重懸浮菌體沉淀，加入溶菌酶（每克濕菌3 mg）作用1.5 h，加脫氧膽酸鈉（每克濕菌4 mg）攪動10 min，再加1 g/L的DNaseⅠ（每克濕菌4 μL），攪拌直至不再粘稠（以上操作均在冰浴進行）；此時向裂菌液中加入等體積的4℃預冷丙酮，混勻，冰浴30 min沉淀全菌蛋白，然后5867 g， 4℃離心10 min收取全菌蛋白沉淀；沉淀用PBS洗滌1遍后與所制備抗血清于37℃搖動共孵2 h吸附去除非特異性反應成分。 將吸附前和吸附后的抗體分別按1∶103， 1∶104， 1∶105， 1∶106稀釋作一抗，對誘導表達Lrp后的全菌蛋白樣品進行Western Blot分析。

　　2.結(jié)果

　　2.1Lrp蛋白的表達與純化誘導2 L菌液，表達后的工程菌經(jīng)超聲裂解后分別取上清和沉淀樣品進行蛋白電泳，結(jié)果顯示目的蛋白在包涵體中。 將所得包涵體用包涵體溶解緩沖液溶解后經(jīng)NiNTA一步純化。 得到約8 mg蛋白，且純度較高。

　　2.2抗血清的檢測用收集未純化抗血清作一抗，以免疫前兔血清為對照對誘導表達Lrp后的全菌蛋白樣品進進行Western Blot分析，結(jié)果顯示（圖3），用所制備的抗血清在69 ku位置明顯雜到了一條預期的條帶，而對照血清泳道相同位置處無相應條帶出現(xiàn)。 說明所制備抗血清中確有一定濃度的抗目的蛋白的抗體。

　　2.3Lrp抗體的制備純化及特異性鑒定免疫新西蘭大白兔后，獲得抗血清。 抗體吸附純化后，以分別按1∶103， 1∶104， 1∶105， 1∶106稀釋純化前和純化后的抗兔血清作為一抗，用Western印跡方法檢測全菌蛋白樣品。 結(jié)果顯示純化前后的抗血清在69 ku處均檢測到了目的蛋白條帶，說明所制備抗體可以與所表達目的蛋白結(jié)合；但純化前抗體所檢測到的非特異條帶較多，而純化后抗體Western印跡結(jié)果就只有一條目的條帶。 說明吸附純化后得到了高特異性的抗血清，并且其免疫印跡的效價在10-6以上。

　　3.討論

　　LPS是細菌內(nèi)毒素，與某些炎癥的發(fā)生密切相關(guān)［1］。 它是G-細菌感染的主要致病因子，也是一種危及人類健康乃至生命的重要的病原菌相關(guān)模式分子（pathogenassociated molecular pattern， PAMP）。 LPS進入體循環(huán)時，就會形成內(nèi)毒素血癥，引起明顯的病理生理反應。

　　近年來的實驗顯示［4］， LPS除引起危及生命的G-菌毒血癥外， 也參與一些局部特定疾病，如泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多個系統(tǒng)疾病。 目前認為LPS也是引起人和實驗動物中毒性休克的主要因素［5］。 而所有這些作用的發(fā)揮，都是藉一系列被稱為模式識別受體（pattern recognition receptors， PRRs）［6］的膜蛋白分子對LPS識別［7-9］，以及一系列相關(guān)的胞內(nèi)信號傳導途徑對所識別信號的傳遞和放大來實現(xiàn)的。 LPS信號傳導途徑非常復雜，單憑現(xiàn)有的信號傳導分子很難解釋其中的一些通路。 研究LPS的致病機制，必須尋找新的信號傳導分子。

　　人lrp就是新發(fā)現(xiàn)的一種LPS應答基因。 功能位點的分析發(fā)現(xiàn)， lrp的基因序列中包含兩條相互重疊的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)［Lx（6） Lx（6）Lx（6）L］。 亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)是DNA結(jié)合蛋白的特征型結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)往往出現(xiàn)在幾種特定的蛋白質(zhì)中：即與細胞生長代謝相關(guān)的分子中（如轉(zhuǎn)錄因子、癌基因）。 對lrp進行研究可能會有助于進一步認識LPS介導的信號轉(zhuǎn)導通路，增加對炎癥反應分子機制的認識。 并可能為內(nèi)毒素血癥等LPS相關(guān)疾病尋找新的治療靶點。

　　本實驗成功制備了高效價高特異性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗體，為Lrp功能的進一步研究提供了重要的實驗工具。

　　【參考文獻】

　　［1］ 宋慶賀， 柴玉波， 陳蘇民，等。 人lrpcDNA全長編碼區(qū)的克隆及其在大腸桿菌中的表達［J］。 第四軍醫(yī)大學學報， 2006，27（5）：458-461.

　?。?］ Zhao ZL. Direct cloning of cell differential expression genes with full length by a new strategy［J］。 J Biotechnol， 1999，73（1）：35-42.

　?。?］ Chai YB. Development of an improved subtractive hybridization and batch cloning of LPS specific response genes from human dental pulp cells［J］。 J Dental Res， 2001， 18（5）：126-130.

　?。?］ Inada T， Hamano N， Yamada M， et al. Inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factoralpha in delayed gastric emptying and gastrointestinal transit induced by lipopolysaccharide in mice［J］。 Braz J Med Biol Res， 2006， 39（11）：1425-1434.

　?。?］ Hwang YH， Park BK， Lim JH， et al. Lipopolysaccharidebinding and neutralizing activities of surfactin C in experimental models of septic shock［J］。 Eur J Pharmacol， 2007， 556（13）：166-171.

　?。?］ Muta T. Molecular basis for invertebrate innate immune recognition of （1——>3）betaDglucan as a pathogenassociated molecular pattern［J］。 Curr Pharm Des， 2006，12（32）：4155-4161.

　?。?］ Tang X， Metzger D， Leeman S， et al. LPSinduced TNFalpha factor （LITAF）deficient mice express reduced LPSinduced cytokine： Evidence for LITAFdependent LPS signaling pathways［J］。 Proc Natl Acad Sci USA， 2006，103（37）：13777-13782.

　?。?］ Trent MS， Stead CM， Tran AX， et al. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis［J］。 J Endotoxin Res， 2006，12（4）：205-223.

　?。?］ Doyle SL， ONeill LA. Tolllike receptors： from the discovery of NF kappa B to new insights into transcriptional regulations in innate immunity［J］。 Biochem Pharmacol， 2006， 72（9）：1102-1113.