【摘要】  Dopuin/Cox17p是新近從酵母和豬小腸中發(fā)現和鑒定的一種生物活性肽，分子量8057 D左右，加工成熟的活性形式由62個氨基酸殘基組成。從DNA和蛋白質數據庫中發(fā)現，動物中的瘧原蟲、瘧蚊、果蠅和鯊、蛇，以及植物中的擬南芥均存在對應肽，鼠和人的cDNA庫中也有對應序列。盡管因種屬不同在一級結構上略有差異，但其N端脯氨酸密集，22、23、25、35、44和54位點為6個半胱氨酸，從豬小腸純化肽的3對鏈內二硫橋鍵已定位。在酵母中，此肽主要分布于線粒體內膜，捕獲細胞膜上的Cu+，為氧化還原復合多酶體系成員，在呼吸鏈末端傳遞電子將O2還原為H2O.同時，它在內分泌系統中起著激素的作用?，F將Dopuin/Cox17p肽的生理功能及其基因表達調節(jié)方面的有關研究進行綜述如下。此肽與機體能量代謝的酶活性相關，有重要理論和臨床研究價值。

　　【關鍵詞】  Dopuin/Cox17p；氧化磷酸化；腺苷酸?；?；銅，轉運

　　Dopuin/Cox17p：a new bioactive peptide

　　LI Fa-fang，CHEN Zheng-wang.Science Experiment Center，Youjiang National Medical College，Baise 533000，China

　?。跘bstract］    Dopuin/Cox17p is a new bioactive peptide which has been demonstrated in yeast and porcine intestine recently.They are about 8057 Da which consist of 62-residue.According to Swiss-PROT，they also exist in plasmodium，anopheles，drosophila，king cobra and shark.cDNA sequence of mouse and human are homologous.Though their primary structure are different with their species，they all have rich proline exists in N-terminal and 6-Cys locates in 22，23，25，35，44 and 54.Three intrachain disulphide bonds have been found in porcine intestine peptide.They locates in the membrane of mitochondria in yeast.When they go out to cell membrane they capture Cu+，and now are accepted as a new member of polyoxidoreductase.They take part in the electron transformation and the reduction of oxygen to water.Also，They act as hormone in nerve and endocrine system.This article summarizes the expression and the function of dopuin/Cox17p in creatures.We think that it‘s necessary to develop their relative drugs，because they take high interaction with the enzyme’s activation of energy metabolisming and human disease of copper absent.

　　［Key words］  dopuin/Cox17p；oxidative phosphorylation；deadenylation；copper transportation

　　現代社會物質極大豐富，腦力工作時間多于體力工作時間，體能儲藏多，消耗少。生理性患病危險因素的生物學根源是脂、淀粉等高能量物質吸取太多，將體內的脂、淀粉分解成能量消耗的能力低下，大量粥樣脂肪沉積在血管內表面，使動靜脈血管管腔狹窄、血壓升高、血管脆性增加、冠狀動脈同樣成為粥樣硬化、狹窄而心肌供血不足，導致心絞痛、心

　　肌梗死、心律失常或心力衰竭等，更嚴重者可導致呼吸停止。針對該癥狀篩選生物能量活性肽，激活細胞產能代謝，促進人體細胞活力，增加脂肪代謝，降低血脂。開發(fā)健康食品，提高Dopuin/Cox17p蛋白質供應量，增強機體能量代謝，讓人們在工作生活中充滿活力。

　　1  Dopuin/Cox17p的發(fā)現及其在生物體中的分布

　　當尋找新的胃腸多肽激素時，Chen等［1］1997年從豬小腸中分離得到了一種含62個氨基酸的多肽，命名為dopuin：do意為多（many）；pu即脯，脯氨酸（proline）；in，音為因（factor）；即一個富含脯氨酸的多肽因子，其鏈內二硫橋鍵已被定位（圖1）。Glerum等［2］1996年發(fā)現了一個酵母基因的產物，是組裝細胞色素氧化酶（cytochrome-oxidase）復合體的成員，命名Cox17p.1997年，Amaravadi等［3］克隆出一種與人肌肉功能相關的蛋白，其功能和酵母Cox17p一致，也稱之為Cox17p，其氨基酸排列和Dopuin有94%的同源性，它們是存在于不同生物中的同一功能蛋白（肽），文獻中統稱Dopuin/Cox17p.

　　Beers等［4］利用酵母表達并純化出Dopuin/Cox17p，發(fā)現每摩爾蛋白中含0.2～0.3 mol銅。將完整線粒體置于低滲條件下，又發(fā)現其中大部分Dopuin/Cox17p以可溶性蛋白質釋放出去，這表明Cox17p存在于線粒體膜上［5］。Dopuin/Cox17p屬于核編碼蛋白，在細胞質中為二聚體，運輸到線粒體內膜組織為呼吸鏈復合酶體系時，則折疊成四聚體行使功能，在生理狀態(tài)下以20 mM穩(wěn)定存在。經Northern雜交檢測，它在神經、內分泌細胞的含量遠高于成纖維細胞。腦內的Dopuin/Cox17p主要位于垂體，含量在出生前后明顯不同，在胚胎發(fā)育早期的心臟中即有表達。這些發(fā)現有助于了解個體在不同發(fā)育時期不同組織的功能。

　　Dopuin/Cox17p廣泛存在于進行有氧呼吸的動、植物中［6，7］。用人類cDNA轉化酵母Cox17突變株，能使該基因喪失的酵母線粒體呼吸功能得到恢復。植物擬南芥AtCox17p與Cox17p的功能完全一致。

　　2  基因結構

　　Dopuin/Cox17p的基因結構已經研究［8～10］。人的基因，位于染色體3長臂，約8 kb，可編碼450 bp.老鼠位于16號染色體，有6 kb，含3個外顯子。老鼠cDNA實驗證明，起始密碼子上游的80 bp處富含GC片斷，能結合Sp1的轉錄因子，轉錄起始點不含TATA/CAAT框，但含有Cox17p亞基的NRF-1和NRF-2的轉錄因子結合位點。和氧化還原復合酶其他基因的轉錄機制一樣，Sp1、NRF-1和NRF-2位于該基因5‘端-155-70 bp轉錄片斷內，為主要轉錄起始點?；騿幼游挥诘谝粋€外顯子一側的85 bp處，多聚腺苷?；稽c則在轉錄終止子下游的3233和3293處。

　　3  基因表達及調節(jié)

　　在神經細胞中，線粒體功能蛋白在突觸前神經末端合成［11］。酵母中mRNA的剪接從多聚A尾開始，多聚腺苷酸酰化通常由mRNA 3‘端非編碼區(qū)（3’-UTRs：3‘-untranslated regions）成分調控。Pufp（Pumilio家族）包含JSN1/PUF1、PUF2、PUF3、PUF4和MPT5/PUF5，是3’-UTRs的反式作用因子，能提高腺苷酸酰化比率［12］。PUF3結合到mRNA 3‘-UTRs，活化腺苷酸酰化酶（Ccr4p/Pop2p/Not），促進mRNA的剪切［13］。Pab1p［poly（A） binding protein］從多聚A尾上解離能限制腺苷酸?；壤opuin/Cox17p基因結構、表達與調節(jié)見圖2.

　　4  蛋白質結構及功能

　　研究者分別從酵母DNA、小鼠RT-PCR擴增片斷、豬內純化活性肽和人的cDNA中分析了Dopuin/Cox17p的氨基酸序列。酵母與人的序列一致性為24%，鼠與人的一致性為92%，豬與人的一致性為94%，見圖3.

　　Dopuin/Cox17p分子量為8057 Da左右，是電子傳遞鏈中細胞色素氧化酶（cytochrom-oxidase：CCO，又稱細胞色素aa3復合物）的組分。每個單分子螯合3個Cu+，所形成的三角形單體被X射線光譜和紫外光譜驗證［14，15］。傅立葉變換（FT：Fourier transform）顯示了二銅核復合體［16］。酵母中銅的吸收，見圖4.Dopuin/Cox17p之所以能穩(wěn)定運送Cu2+到線粒體內膜，是因為Cu+結合到該蛋白的Cys-Cys-Xaa-Cys中［17］，它使得這一功能在物種中高度保守。該復合體保存了球狀折疊模式［18］，球中螯合Cu+的界面氨基酸殘基互補，從而減小了運送過程中的活性障礙［19］。Cu+在細胞色素傳遞電子及氧化還原反應中發(fā)生價態(tài)變化（Cu+～Cu2+），每次將電子從細胞色素氧化酶傳遞給O2能產生103.8 kJ/mol能量。Dopuin/Cox17p只有在胚胎形成6.5天［20］以后才能組裝復合酶體，在線粒體的能量代謝中表現酶活性。Dopuin/Cox17p突變后，呼吸功能可被Sco1p恢復［21］，Sco1p將色素復合酶體錨定膜上［22］，是線粒體內膜蛋白［23］。人工Dopuin/Cox17p與天然產物一樣，微摩爾濃度即能明顯促進成纖維細胞NIH3T3成活。它不僅是呼吸鏈復合酶體的功能成分，也在內分泌系統中起作用，能微弱抑制胰腺胰島素分泌。

　　5  其他

　　缺銅動物肝臟、心臟、腎臟、腦、小腸、脾、胸腺和骨髓的酶活性均降低，但含銅過量則會產生毒副作用。大腦脈絡膜復合體通過吞、吐方式調整大腦中銅的濃度［24］。到目前為止，發(fā)現至少有三種蛋白（Cox17p、Sco1p和Sco2p）與Cu+運輸到呼吸鏈有關［25］，人呼吸鏈復合酶含5個基因：Bcs1，Cox15，Pet112，Cox11和Sco 1［26］。在同一生物體中，金屬硫蛋白（MT：metallothionein）是目前唯一已知和Dopuin/Cox17p同源的蛋白質，它們以同樣的機制運送不同的金屬離子到線粒體膜［27］，氨基酸（如Lys）突變會抑制線粒體能量代謝的酶活性［28］。根據目前研究狀況，進一步開展Dopuin/Cox17p的理論和應用研究，對豐富保健、臨床藥品、增強人體活力具有不可替代的作用。

　　【參考文獻】

　　1 Chen ZW，Bergman T，stenson CG.et al.Characterization of Dopuin，a polypeptide with special residue distributions.Eur J Biochem，1997，249：518-522.

　　2 Glerum DM，Shtanko A，Tzagoloff A.Characterization of Cox17，a yeast gene involved in copper metabolism and assembly of cytochrome oxidase.J Biol Chem，1996，271（24）：14504-14509.

　　3 Amaravadi R，Glerum DM，Tzagoloff A.Isolation of a cDNA encoding the human homolog of Cox17，a yeast gene essential for mitochondrial copper recruitment.Hum Genet，1997，99（3）：329-333.

　　4 Beers J，Glerum DM，Tzagoloff A.Purification，characterization，and localization of yeast Cox17p，a mitochondrial copper shuttle.J Biol Chem，1997，272（52）：33191-33196.

　　5 Heaton DN，George GN，Garrison G，et al.The mitochondrial copper metallochaperone Cox17 exists as an oligomeric，polycopper complex.Biochemistry，2001，40（3）：743-751.

　　6 Kako K，Tsumori K，Ohmasa Y，et al.The expression of Cox17p in rodent tissues and cells.Eur J Biochem，2000，267（22）：6699-6707.

　　7 Balandin T，Castresana C.AtCox17，an arabidopsis homolog of the yeast copper chaperone Cox17.Plant Physiol，2002，129（4）：1852-1857.

　　8 Punter FA，Adams DL，Glerum DM.Characterization and localization of human Cox17，a gene involved in mitochondrial copper transport.Hum Genet，2000，107（1）：69-74.

　　9 Takahashi Y，Kako K，Arai H，et al.Characterization and identification of promoter elements in the mouse Cox17 gene.Biochim Biophys Acta，2002，1574（3）：359-364.

　　10 Takahashi Y，Kako K，Ohmura K，et al.Genomic structure of mouse copper chaperone，COX17.DNA Seq，2001，12（5～6）：305-318.

　　11 Gioio AE，Eyman M，Zhang H，et al.Local synthesis of nuclear-encoded mitochondrial proteins in the presynaptic nerve terminal.J Neurosci Res，2001，64（5）：447-453.

　　12 Olivas W，Parker R.The Puf3 protein is a transcript-specific regulator of mRNA degradation in yeast.Embo J，2000，19（23）：6602-6611.

　　13 Tucker M，Staples RR，Valencia-Sanchez MA，et al.Ccr4p is the catalytic subunit of a Ccr4p/Pop2p/Notp mRNA deadenylase complex in Saccharomyces cerevisiae.Embo J，2002，21（6）：1427-1436.

　　14 Takenouchi T，Fujimoto M，Shimamoto A，et al.Isolation and characterization of Cox17p from porcine heart by determining its survival-promoting activity in NIH3T3 cells.Biochimicaet Biophysica Acta，1999，1472：498-508.

　　15 Srinivasan C，Posewitz MC，George GN，et al.Characterization of the copper chaperone Cox17 of Saccharomyces cerevisiae.Biochemistry，1998，37（20）：7572-7577.

　　16 Eisses JF，Stasser JP，Ralle M，et al.Domains Ⅰ and Ⅲ of the human copper chaperone for superoxide dismutase interact via a cysteine-bridged Dicopper（I） cluster.Biochemistry，2000，39（25）：7337-7342.

　　17 Heaton D，Nittis T，Srinivasan C，et al.Mutational analysis of the mitochondrial copper metallochaperone Cox17.J Biol Chem，2000，275（48）：37582-37587.

　　18 Harrison MD，Jones CE，Dameron CT.Copper chaperones：function，structure and copper-binding properties.J Biol Inorg Chem，1999，4（2）：145-153.

　　19 Huffman DL，O‘Halloran TV.Function，structure，and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.Annu Rev Biochem，2001，70：677-701.

　　20 Takahashi Y，Kako K，Kashiwabara S，et al.Mammalian copper chaperone Cox17p has an essential role in activation of cytochrome C oxidase and embryonic development.Mol Cell Biol，2002，22（21）：7614-7621.

　　21 Glerum DM，Shtanko A，Tzagoloff A.SCO1 and SCO2 act as high copy suppressors of a mitochondrial copper recruitment defect in Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem，1996，271（34）：20531-20535.

　　22 Chinenov YV.Cytochrome coxidase assembly factors with a thioredoxin fold are conserved among prokaryotes and eukaryotes.J Mol Med，2000，78（5）：239-242.

　　23 Buchwald P，Krummeck G，Rodel G.Immunological identification of yeast SCO1 protein as a component of the inner mitochondrial membrane.Mol Gen Genet，1991，229（3）：413-420.

　　24 Nishihara E，Furuyama T，Yamashita S，et al.Expression of copper trafficking genes in the mouse brain.Neuroreport，1998，9（14）：3259-3263.

　　25 Horvath R，Lochmuller H，Stucka R，et al.Characterization of human SCO1 and COX17 genes in mitochondrial cytochrome-c-oxidase deficiency.Biochem Biophys Res Commun，2000，276（2）：530-533.

　　26 Petruzzella V，Tiranti V，Fernandez P，et al.Identification and characterization of human cDNAs specific to BCS1，PET112，SCO1，COX15，and COX11，five genes involved in the formation and function of the mitochondrial respiratory chain.Genomics，1998，54（3）：494-504.

　　27 Schwarz MA，Lazo JS，Yalowich JC，et al.Cytoplasmic metallothionein overexpression protects NIH3T3 cells from tert-butyl hydroperoxide toxicity.J Biol Chem，1994，269：15238-15243.

　　28 Ye B，Maret W，Vallee BL.Zinc metallothionein imported into liver mitochondria modulates respiration.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（5）：2317-2322.