【關鍵詞】  白藜蘆醇；慶大霉素，自由基

　　Antifree radical activity of resveratrol in guinea pig cochlea

　　3Department of Otorhinolaryngology， Xijing Hospital，  Fourth Millitary Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】 AIM：  To study the prevention of gentamicin （GM） ototoxicity by resveratrol （Res） in guinea pig. METHODS：  Auditory brainstem response， cochlear preparation and transmission electron microscope were used to evaluate  the effects of hair cell on hearing threshold and the morphology of hair cell. Serum levels of GM was also tested. Guinea pigs were randomly assigned to 3 groups （GMtreated alone， GM and Res in combination and one control group）。 Serum levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） were also tested. RESULTS： MDA concentration in serum of the GM+Res group was significantly lower than that in the GM group （P<0.05）， while SOD level was much higher than that in the GM group （P<0.05）。 Res did not alter the serum level of GM. Morphological results were consistent with functional changes. The worst damages occurred in the basal circles. Damages in upper circles were lighter. GM mainly impaired the outer hair cells， on which Res had protective effect. CONCLUSION： Res may be a promising therapeutic agent to clean out free radical.

　　【Keywords】 resveratrol； gentamicins； free radical

　　【摘要】 目的：觀察白藜蘆醇（Res）的抗自由基作用。 方法：將豚鼠隨機分為3組：慶大霉素組（GM組）；Res＋GM組；空白對照組，每組動物10只。 測定聽性腦干反應（ABR）、耳蝸鋪片、動物血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量及GM血藥濃度，觀察Res對自由基的影響。 結果：GM+Res組血液中MDA較GM組明顯減少（P<0.05）；GM+Res組SOD活性明顯高于GM組（P<0.05）。  Res對GM的血藥濃度無影響。 耳蝸鋪片結果顯示空白對照組毛細胞排列整齊，無損傷；GM組底圈毛細胞損傷嚴重，向上逐漸減輕，與聽閾升高的程度相平行。 而GM+Res組的毛細胞部分消失，與GM組比較損傷較輕。 結論：Res能對豚鼠體內(nèi)自由基含量產(chǎn)生很明顯的影響，對GM引起的耳毒性有保護作用。

　　【關鍵詞】 白藜蘆醇； 慶大霉素；自由基

　　0.引言

　　在氨基糖苷類藥物的耳毒性機制中，自由基是目前比較完善的學說之一［1-2］。 在正常機體內(nèi)會有少量的自由基存在，病理狀態(tài)下，自由基含量會增加，直接造成細胞各成分損害，引起其代謝和功能障礙。 白藜蘆醇（resveratrol， Res）屬于非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于種子植物中。 結構中有三個酚羥基，在機體中可以競爭性結合自由基，從而減少自由基含量，達到清除自由基的作用。 中藥虎杖和葡萄皮中含有大量的Res，具有很大的藥用價值［3］。 丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是檢測自由基的重要參數(shù)。 我們將Res與慶大霉素（gentamicin， GM）用于動物后通過檢測動物血清中MDA，SOD的含量以及觀察聽性腦干反應（auditory brainstem response， ABR）和細胞形態(tài)學的變化來研究Res對自由基的作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料

　　耳廓反射正常的健康雄性雜色豚鼠30只，體質(zhì)量250～350 g（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心）；硫酸GM（西安高科陜西金方藥業(yè)公司）；Res（西安交大保賽生物技術股份有限公司）；MDA，SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.2方法

　　1.2.1動物分組及處理

　　將30只豚鼠隨機分為3組，每組10只。 ①GM組： 120 mg/kg皮下注射GM，1次/d，連續(xù)3 wk； ②Res＋GM組：用Res 375 mg/kg灌胃；GM 120 mg/kg皮下注射，1次/d，連續(xù)3 wk；③空白對照組：不給試驗動物任何藥物。 在動物實驗期間每天秤體質(zhì)量以調(diào)整用藥量。 用藥前及用藥后第1，3，4和6 wk檢測ABR，在用藥后第1，3 wk分別取血檢測血清中MDA，SOD含量及血清中GM含量；第4次測ABR后每組取2只豚鼠耳蝸，供光鏡觀察耳蝸鋪片。

　　1.2.2ABR反應閾檢測

　　豚鼠的ABR 以Ⅲ波最為顯著。 動物在戊巴比妥鈉40 mg/kg皮下注射麻醉后，將針型記錄電極置前額正中皮下，參考電極置測試耳外耳道口后上皮下，鼻尖接地。 用Biologic 聲刺激器，286計算機自動采樣，采用短純音（tone burst，上升下降時間各2 ms，平臺時間1 ms） 1 kHz，8 kHz刺激，間隔75 ms，掃描時間20 ms，疊加256次，帶通濾波80～1500 Hz，在屏蔽隔聲室內(nèi)常規(guī)測試。

　　1.2.3耳蝸硬鋪片標本制備［4］

　　將動物麻醉致死，取出聽泡暴露骨性耳蝸，于顯微鏡下在冰盒內(nèi)快速摘除鐙骨，刺破圓窗，挑開蝸頂； 用5～10 g/L AgNO3分別從蝸尖和蝸底圓窗反復灌注，完畢后將標本浸入5～10 g/L AgNO3液體中，置4℃冰箱15～20 min，用 25 mL/L戊二醛固定灌注標本，灌注方法同上，放入冰箱內(nèi)固定2～4 h，取出標本在陽光下曝光40～60 min使標本由黃色變成黑色，再置于25 mL/ L戊二醛于4℃冰箱固定24 h，解剖顯微鏡下常規(guī)制備，分離各圈基底膜，甘油封片。

　　1.2.4檢測血清中MDA，SOD

　　用藥后19 d于各組動物心肌取血。 離心，取血清-20℃凍存。 采用MDA，SOD試劑盒，按說明操作檢測。

　　2.結果

　　實驗中GM組2只動物死亡，死前均消瘦、耳廓反射消失、無力。 GM+Res組有1只動物死亡。 空白對照組無死亡。

　　2.1ABR檢測結果

　　用藥后各組動物ABR出現(xiàn)閾移。 1  KHz ABR閾移：GM組（28.8±2.9）dB；Res＋GM組（5.2±2.9） dB ，兩組間差異顯著（P<0.01）。 8 kHz ABR閾移： GM組（40.3±3.7） dB； Res+GM組（12.4±2.2） dB，兩組間差異顯著（P<0.01）高頻聽力損失比低頻重。

　　2.2用藥后兩組動物的耳蝸鋪片比較

　　空白對照組耳蝸鋪片毛細胞排列整齊，無缺失。 GM組底圈毛細胞損傷最重，底圈和第二圈外毛細胞損失嚴重，向上逐漸減輕，與聽閾升高的程度相平行。 而Res＋GM組相對較輕。

　　2.3MDA含量和SOD活力

　　用藥1，3 wk時，Res+GM組血清的MDA含量均低于GM組，差異顯著（P<0.05）； GM組血清SOD活力均低于Res＋GM組（P<0.01）。

　　2.4腎功檢測結果

　　用藥1，3 wk時，Res + GM組血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）均明顯低于GM組（P<0.05，表1）。圖5白藜蘆醇組3 wk時毛細胞部分消失×400

　　2.5血清濃度組間血清GM濃度

　　無顯著差異（P>0.05）；Res對GM的血藥濃度無影響。

　　3.討論

　　近年來，天然藥物由于其毒副作用小，藥物來源范圍廣泛等原因，在新藥研制領域受到越來越多的重視和關注。 Res屬于非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于種子植物中。 Res的結構中有三個酚羥基，在機體中可以競爭性結合自由基，從而減少自由基含量，達到清除自由基的作用。 而氨基糖甙類抗生素的耳毒作用機制之一為自由基學說。 此學說認為正常機體組織內(nèi)有少量的自由基存在，病理狀態(tài)下自由基含量會增加，其中以氧族羥基自由基為主，由于性質(zhì)不穩(wěn)定，氧化作用強，對膜結構的攻擊最為嚴重，能引起膜脂質(zhì)氧化，通透性增加造成細胞死亡［5-6］。 我們的結果顯示Res與GM同時使用具有保護GM所致耳蝸損傷時耳蝸的SOD活性作用， 增強了內(nèi)源性氧自由基清除酶的功能， 抑制脂質(zhì)過氧化反應， 減少氧自由基的代謝產(chǎn)物MDA， 從而保護耳蝸毛細胞： 試驗有Res+GM組和GM組的聽閾有明顯差異，SOD 和MDA的數(shù)據(jù)顯示，Res+GM組和GM組有明顯差異，具有統(tǒng)計學意義。 耳蝸鋪片照片顯示：GM組的毛細胞損傷情況比Res+GM組嚴重。 Res+GM組對耳蝸毛細胞有保護作用。 腎功檢測結果也顯示Res 對GM的腎毒性有保護作用，由以上結果可看出Res是一種有效的自由基清除劑并且對GM的毒性有抑制作用。 但是否具有直接清除氧自由基的作用，還有待于進一步研究。

　　【參考文獻】

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