【關(guān)鍵詞】  神經(jīng)干細(xì)胞；培養(yǎng)鑒定；移植

　　0引言

　　神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells， NSCs）在臨床應(yīng)用中有廣闊的前景，對它的研究一直是近年來的熱點(diǎn)，現(xiàn)對NSCs的生物學(xué)特性，培養(yǎng)鑒定以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，缺血損傷和腫瘤治療等方面的研究進(jìn)展做一概述。

　　1NSCs的存在部位和生物學(xué)特性

　　1.1存在部位在哺乳類動物胚胎期的紋狀體、海馬、腦皮層、視網(wǎng)膜、脊髓、嗅球、側(cè)腦室的腦室區(qū)、室下區(qū)均發(fā)現(xiàn)有NSCs存在，成年后，NSCs主要存在于嗅球、皮層、側(cè)腦室及脊髓的室管膜、部分室管膜下區(qū)和海馬齒狀回等部位。 目前已明確，成年哺乳動物腦內(nèi)的側(cè)腦室腦室下區(qū)（svz）和海馬結(jié)構(gòu)的顆粒下區(qū)（SGz） 可產(chǎn)生大量的神經(jīng)元［1］。

　　1.2生物學(xué)特性NSCs具有無限的增殖分裂能力，它的主要生物學(xué)特征包括：具有多向分化潛能，能分化成本系大部分類型的細(xì)胞即神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；具有自我更新和自我維持的能力。 NSCs通過兩種細(xì)胞分裂方式，即不對稱分裂和對稱分裂。 不對稱分裂時(shí)由于啟動了某種細(xì)胞機(jī)制，使細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)分化的蛋白質(zhì)不均勻地分配而分裂產(chǎn)生一個(gè)新的干細(xì)胞和一個(gè)祖細(xì)胞，通過這種分裂方式產(chǎn)生一系列分化程度不同的子代細(xì)胞，以滿足神經(jīng)細(xì)胞多樣性的需求。 一次對稱分裂產(chǎn)生兩個(gè)干細(xì)胞或兩個(gè)祖細(xì)胞。 祖細(xì)胞僅具有單向或雙向分化能力或其干細(xì)胞特性只能維持較短的時(shí)間［2］。 在多數(shù)情況下，成體干細(xì)胞分化為與其組織來源一致的細(xì)胞，但是在某些情況下，成體干細(xì)胞的分化并不遵循該規(guī)律，表現(xiàn)出很強(qiáng)的跨系或跨胚層分化潛能。 Galli等［3］將從人胚胎和成年小鼠分離的NSCs與骨骼肌的成肌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NSCs可分化為骨骼肌細(xì)胞，用胚胎和成年的NSCs以及體外克隆的NSCs移植給亞致死劑量照射的小鼠，結(jié)果證明NSCs可轉(zhuǎn)化為造血細(xì)胞。

　　2NSCs的培養(yǎng)和鑒定

　　2.1NSCs的培養(yǎng)目前的NSCs多采用無血清細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞克隆技術(shù)分離。 培養(yǎng)液在使用合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加谷酰胺、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮、腐胺和具有絲裂原作用的生長因子（如EGF， bFGF等）。 待原代克隆形成后挑選單個(gè)克隆機(jī)械分離繼續(xù)進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，也可采用單細(xì)胞克隆分離。 干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液中生長時(shí)呈懸浮球形，不貼壁也不生長突起，改變培養(yǎng)液（有血清培養(yǎng)液）后貼壁分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞。 有研究表明，在瓊脂糖抗貼壁培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞有利于神經(jīng)干細(xì)胞持續(xù)增殖并保持未分化狀態(tài)，培養(yǎng)3 mo，神經(jīng)干細(xì)胞的分化率僅為0.64%，而塑料培養(yǎng)瓶的分化率為32.05%，提示瓊脂糖抗貼壁培養(yǎng)法適合神經(jīng)干細(xì)胞在體外長期、大量擴(kuò)增［4］。 此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞貼壁分化加快，神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）陽性細(xì)胞及酪氨酸羥化酶（TH）陽性細(xì)胞明顯多于NSCs單獨(dú)培養(yǎng)組，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可快速誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化［5］。

　　2.2NSCs鑒定標(biāo)志物［6］現(xiàn)在NSCs還沒有特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志物，人們鑒定了在NSCs中表達(dá)的幾種蛋白，它們包括： Nestin， GFAP vimentin， Musashi， CD133等。 體外培養(yǎng)的干細(xì)胞球表達(dá)神經(jīng)上皮細(xì)胞的特異性抗原Nestin，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞的遷移基本完成后Nestin的表達(dá)量開始下降，并隨神經(jīng)細(xì)胞分化的完成而停止表達(dá)，已被廣泛應(yīng)用于NSCs的鑒定。 GFAP vimentin的表達(dá)也比較早，起始于神經(jīng)遷移完成時(shí)，分化完成后其表達(dá)下降。 Musashi可選擇性地在各種哺乳類動物的NSCs、祖細(xì)胞表達(dá)，并在維持干細(xì)胞狀態(tài)和分化中發(fā)揮重要的作用，因此Musashi 被作為哺乳類NSCs的標(biāo)志蛋白。 CD133是一種細(xì)胞表面抗原，分選的CD133陽性的胚胎來源的腦細(xì)胞能增殖形成細(xì)胞球，而CD133陰性的細(xì)胞不能形成細(xì)胞球。 聯(lián)合應(yīng)用CD133表面標(biāo)志及免疫磁珠分選系統(tǒng)可有效地從人胎兒腦組織中直接分離得到高度的CD133陽性干細(xì)胞，細(xì)胞活力不受影響［7］。

　　3NSCs移植治療神經(jīng)退行性疾病

　　有研究表明局灶性腦缺血可增強(qiáng)大鼠皮質(zhì)和尾殼核的增殖能力，部分增殖細(xì)胞分化為神經(jīng)元，參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建但在損傷后完全依靠腦內(nèi)少量的NSCs增殖分化尚不足以修復(fù)損傷的神經(jīng)系統(tǒng)。 大量動物實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)替代和部分重建神經(jīng)回路是可能的。 目前，在嚙吃類和靈長類動物模型已積累了移植NSCs治療帕金森病、缺血性中風(fēng)、膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的大量依據(jù)。

　　3.1帕金森病用于治療帕金森病（Parkinson disease， PD）的多巴胺神經(jīng)元來源有三條途徑：胚胎組織，NSCs體外培養(yǎng)產(chǎn)生多巴胺神經(jīng)元和永生化祖細(xì)胞導(dǎo)入調(diào)節(jié)分化的基因而分化成多巴胺神經(jīng)元，這三種途徑在動物實(shí)驗(yàn)都獲得了成功。 向帕金森病模型大鼠紋狀體分別植入20萬，100萬和200萬人胚NSCs，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞數(shù)目少者更易長出神經(jīng)纖維且不易產(chǎn)生免疫排斥，但在體內(nèi)只發(fā)現(xiàn)了少量TH陽性細(xì)胞［8］。 NSCs聯(lián)合膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）植入PD大鼠紋狀體內(nèi)，能夠明顯提高PD大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量，對PD大鼠有一定的治療作用［9］。 Wagner等［10］的研究證實(shí)甲狀腺激素/維甲酸核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子Nurr 1為中腦多巴胺神經(jīng)元的分化誘導(dǎo)所必需，把人胚多巴胺神經(jīng)元移植到帕金森病患者腦內(nèi)，能夠顯著改善60歲以下的臨床癥狀，但對60歲以上的癥狀未見明顯改善。

　　3.2亨廷頓病亨廷頓病是遺傳性的神經(jīng)元變性疾病，以皮層和新紋狀體最為嚴(yán)重， NSCs植入大鼠亨廷頓病模型腦內(nèi)能保護(hù)維持運(yùn)動習(xí)慣的能力，受損的運(yùn)動習(xí)性也可重新恢復(fù)，表明植入的細(xì)胞在體內(nèi)形成了功能性連接［11］。

　　3.3缺血性中風(fēng)Veizovic等［12］將小鼠NSCs移植入腦缺血大鼠模型腦內(nèi)，NSCs不僅分布在移植一側(cè)的大腦半球，在損傷半球的皮層、紋狀體和胼胝體也有分布。 移植細(xì)胞能夠明顯改善感覺和運(yùn)動功能缺陷，損傷的面積也明顯減少，但對空間學(xué)習(xí)記憶沒有顯著作用。 將胚胎海馬組織移植到全腦缺血受傷的海馬CA1區(qū)，可實(shí)現(xiàn)神經(jīng)回路的重建。 將NSCs移植到中風(fēng)模型大鼠腦內(nèi)，一側(cè)完全偏癱的大鼠恢復(fù)了行走能力。 在血管源性腦缺血中，將血管內(nèi)皮生長因子與NSCs聯(lián)合移植，有助于缺血損傷區(qū)域恢復(fù)，腦萎縮較輕［13］。 NSCs移植為恢復(fù)缺氧、缺血腦的功能提供了新的思路。

　　3.4阿爾茨海默病阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）亦稱老年性癡呆，它是以進(jìn)行性癡呆為特征的大腦退行性變性疾病，AD在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)成為僅次于心血管病、腫瘤和卒中而位居第4位的致死原因。 Qu等［14］將人NSCs體外擴(kuò)增后移植到24 mo大鼠側(cè)腦室，4 wk后這些細(xì)胞非常有序地遷移到大腦廣泛部位，包括大腦皮層和海馬，并分化為神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，部分細(xì)胞長出樹突軸突并和宿主建立突觸聯(lián)系，用Morris水迷宮評價(jià)動物認(rèn)知功能，發(fā)現(xiàn)由衰老引起的記憶損傷大鼠在NSCs移植后認(rèn)知功能顯著改善，對正常成年鼠和記憶未損傷老年鼠的認(rèn)知功能未有明顯影響。

　　3.5腦膠質(zhì)瘤腦膠質(zhì)瘤是臨床最常見的顱內(nèi)腫瘤，藥物和放療效果欠佳，手術(shù)完全切除較困難且易復(fù)發(fā)。 NSCs作為外源基因的載體可應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的基因治療，能夠彌補(bǔ)病毒載體的一些不足，其優(yōu)點(diǎn)是既可以穩(wěn)定表達(dá)外源的殺傷基因，對瘤細(xì)胞起到持續(xù)性殺傷作用，又可以和正常腦組織整合，修復(fù)由于腫瘤侵襲的腦組織。 Aboody等［15］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NSCs植入膠質(zhì)瘤鼠體內(nèi)腫瘤后，它們會遍布整個(gè)腫瘤，并隨腫瘤向其他部位遷移；如果植入腦內(nèi)遠(yuǎn)離腫瘤的部位，NSCs也會穿過正常組織向腫瘤部位遷移。 目前對NSCs向腫瘤趨向性遷移的機(jī)制還不十分清楚，可能與腫瘤細(xì)胞釋放的某些因子或被腫瘤所破壞的腦組織釋放的某些因子有關(guān)。

　　總之，NSCs的體外培養(yǎng)成功為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化及治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的思路。 隨著研究的深入，NSCs移植將有可能成為治療神經(jīng)變性疾病和腦損傷的有效手段。 NSCs可以分離、培養(yǎng)并用細(xì)胞因子進(jìn)行分化之后將其移植；也可將體內(nèi)的NSCs激活、分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。 最理想的策略是從需要治療的患者體內(nèi)取出NSCs用于自身治療，有研究表明成年大鼠嗅粘膜NSCs可在普通培養(yǎng)基中形成干細(xì)胞克隆球，嗅粘膜中的其他細(xì)胞作為NSCs的基底飼養(yǎng)細(xì)胞有助于干細(xì)胞克隆球的形成，此方法簡便、安全，為嗅粘膜NSCs自體移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可行性研究提供了動物實(shí)驗(yàn)資料［16］。 目前對NSCs的研究已取得了很多成果，但仍存在許多急于解決的問題：如對NSCs的分化和功能修復(fù)機(jī)制還不甚清楚，移植后的細(xì)胞能否與體內(nèi)細(xì)胞相結(jié)合，建立起正常的神經(jīng)系統(tǒng)突觸聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。 移植到體內(nèi)的NSCs與機(jī)體有無免疫排斥反應(yīng)，是否能獲得成熟神經(jīng)元的全部特性仍沒有搞清楚。 有報(bào)道表明睪丸支持細(xì)胞（Sertoli 細(xì)胞） 能夠分泌許多營養(yǎng)、調(diào)節(jié)、免疫抑制因子，它與胚胎神經(jīng)細(xì)胞同移植可以提供營養(yǎng)并有抗免疫排斥的功能，不僅可以促進(jìn)病情恢復(fù)還可以減少長期應(yīng)用免疫抑制劑的危險(xiǎn)［17］。 相信隨著研究的不斷深入，我們會取得更多的研究成果，NCSs一定能夠在臨床應(yīng)用中發(fā)揮其重要的作用。

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