【摘要】反向遺傳操作技術(shù)（reverse genetics， RG）是近年來比較熱門的一門技術(shù)，該技術(shù)可以在DNA水平上對病毒基因組進行各種修飾或改造，然后通過拯救病毒的表型變化來判斷這些基因操作的效果，從而可以對病毒基因組表達調(diào)控機制、病毒致病的分子機理等進行研究。 我們通過對近年來國外有關(guān)文獻的回顧，希望能夠正確看待病毒拯救技術(shù)的利弊，注意生物安全性，希望能夠為防治可能發(fā)生的流感病毒流散和傳播提供新的思路。

　　【關(guān)鍵詞】  流感病毒 疫苗 反向遺傳技術(shù)

　　0.引言

　　20 世紀(jì)人類歷史上發(fā)生過4 次流感的大流行，對人類健康和生命安全都造成了嚴(yán)重危害。 最近，H5N1高致病性禽流感病毒全世界范圍內(nèi)的肆虐，又引起了世人廣泛的恐慌。 疫苗的應(yīng)用是主要控制和預(yù)防這種疾病的手段。但是因為抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變，流感病毒的抗原不斷發(fā)生變異，這就需要我們安全、穩(wěn)定、快速的再形成新的疫苗株。 利用反向遺傳操作技術(shù)，使產(chǎn)生流感病毒完全從克隆的質(zhì)粒DNA通過8質(zhì)粒系統(tǒng)，或者改進的少于8質(zhì)粒系統(tǒng)［1］，再共轉(zhuǎn)染合適的細胞從而快速的得到基因修飾的疫苗候選株。 流感防治的前景在于反向遺傳操作技術(shù)在研制更有效的流感疫苗中的應(yīng)用，及對其基因功能的研究。

　　1.禽流感病毒與人流感病毒的關(guān)系及感染人的機制

　　禽流感病毒和人流感病毒都屬于流感病毒，只是因為病毒感染的宿主專一性不同而作相應(yīng)的命名，A， B， C這3型流感病毒中，A型可感染人和禽類，感染禽類的稱為禽流感病毒，感染人的稱為人流感病毒，而影響宿主專一性的主要因素是病毒的M基因、NP基因和PB2基因等。 禽流感病毒感染人之前，一般需先通過中間宿主完成適應(yīng)性轉(zhuǎn)變或?qū)崿F(xiàn)抗原轉(zhuǎn)變，但目前已報道有三類禽流感病毒毒株H5N1， H7N7和H9N2能直接感染人［2］。 其中，只有H5N1可使人發(fā)生嚴(yán)重疾病，另外兩種病毒的感染不會造成人的嚴(yán)重疾病［3］。 禽流感感染人類機制多數(shù)學(xué)者認(rèn)為， 一方面與禽流感結(jié)合受體的改變有關(guān)，使病毒HA蛋白基因發(fā)生突變，主要是從NeuAca2、3Gal受體結(jié)合型向NeuAca2， 6Gal受體結(jié)合型改變； 這種受體結(jié)合的改變是禽流感感染人類的關(guān)鍵步驟； 另一方面，與禽流感自身核蛋白結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，像H3亞型的禽流感226位的谷胺酰氨突變成亮氨酸后和人類受體的結(jié)合能力就將增強［4］。 流感病毒感染人的體細胞后必須進行有效復(fù)制， 才能對人體造成損害。 禽流感不能在人的體細胞內(nèi)進行有效復(fù)制， 這主要是與病毒的核蛋白（PB1， PB2， PA， NP） 有關(guān)， 其中PB2 的組成起決定性作用。

　　由于流感病毒基因組是8節(jié)段負義的RNA，其基因組不具有感染性，各個RNA 片段必須與聚合酶蛋白（PB2， PB1， PA）及核蛋白（NP）結(jié)合在一起形成核糖核蛋白復(fù)合物RNPs才有活性。 病毒感染的第一步是與宿主細胞表面的特異性受體HA結(jié)合，通過融膜進入細胞后，釋放出RNPs，RNPs進入細胞核才開始病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，每個RNA片段單獨組成一個轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄出mRNA和互補RNA（cRNA），mRNA翻譯合成病毒蛋白，cRNA復(fù)制生成病毒負鏈子代RNA，進而在細胞漿中組裝成完整的病毒粒子。  HA 在病毒吸附及穿膜過程中以及決定病毒的致病力方面也均起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用，它能否被裂解為HA1和HA2 兩部分是病毒感染細胞的先決條件，也是決定病毒致病力的主要因素。 通過核苷酸序列分析表明，毒力突變株要么在HA 裂解位點附近丟失糖基化位點，要么在HA 裂解位點后面獲得一個額外的精氨酸。 如HA易于被切割，則毒株具有較高的致病性；反之，則致病力較低［5］。 研究表明HA 可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，是禽流感中最重要的保護性抗原，而且還可以刺激機體產(chǎn)生細胞毒性T 淋巴細胞反應(yīng)。 HA 切割位點的結(jié)構(gòu)是影響其切割性的主要原因，包括位點插入處有多個堿性氨基酸，還有切割位點附近糖基化位點的缺失等，均能使HA 對蛋白切割酶的敏感性增強，從而使病毒致病性提高。 人和禽H5NI流感病毒相比，人H5N1流感病毒的NA柄有19個，從而導(dǎo)致酶活力下降，這種短莖特點是其病毒毒力的決定因素之一［6］。   香港H5N l 毒株中PB2 的第627 位氨基酸產(chǎn)生了由賴氨酸（Lys） 型向谷氨酸（Glu） 型的轉(zhuǎn)化，促使病毒核蛋白的合成， 使病毒在體內(nèi)能有效地進行復(fù)制， 導(dǎo)致這種轉(zhuǎn)化的機制可能與組成PB2 的第199 位氨基酸絲氨酸（Ser） 的突變有關(guān)［7］。  另外，在病毒的進化過程中，同型A IV 在不同進化種系間發(fā)生了基因重組。 這種突變和重組也是決定病毒毒力的因素之一。［醫(yī)學(xué) 教育網(wǎng) 搜集整理］

　　2.以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的反向遺傳操作技術(shù)在流感中的應(yīng)用及其發(fā)展

　　反向遺傳學(xué)是近年來比較熱門的一門技術(shù)，自1978年第1例RNA病毒Qβ噬菌體的成功拯救以來，各類RNA病毒的分子生物學(xué)研究取得了長足的進展，這主要歸功于各種RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立和發(fā)展。 流感病毒是負鏈RNA病毒，基因組是支離破碎的。 200601據(jù)《自然》雜志報道一項電子顯微鏡研究顯示：每個正在發(fā)育的流感病毒粒子含有一個遺傳材料組成的中心桿，這個中心桿被外圍的桿所包圍。 這種高水平的組織可能是決定該病毒感染周期的一個因素，而感染周期可能是新的抗病毒藥物的一個作用目標(biāo)。 而且更主要的是明確了流感內(nèi)部的結(jié)構(gòu)將加速發(fā)展基因遞送和表達的效率［7］，從而也為提高病毒拯救效率奠定理論基礎(chǔ)。 最初研究人員通過純化RNPs蛋白，來獲得流感病毒；1989年，研究人員通過輔助病毒，獲得了流感病毒；1999年，F(xiàn)odor首次通過12質(zhì)粒系統(tǒng)拯救出流感病毒； 2005年Hoffmann等［8］建立了使用雙向轉(zhuǎn)錄表達載體的8質(zhì)粒系統(tǒng)，在同一個模板（載體上）實現(xiàn)vRNA的轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白的表達。 在這種表達載體中，把編碼vRNA的cDNA正向克隆至polⅡ啟動子（從人巨細胞瘤病毒CMV啟動子衍化而來）和終止序列（牛生長激素poly（A）信號aⅡBGH）之間，在此表達盒之間還反向插入了人polⅠ啟動子（PⅠh）和鼠polⅠ終止序列（tⅠ）。 8個基因片段cDNA分別克隆后轉(zhuǎn)染真核細胞，在同一個模板上由polⅠ控制合成負鏈vRNA，由polⅡ控制合成正鏈mRNA并表達蛋白質(zhì)。 但由于使用同一個模板獲得蛋白表達和vRNA合成，又會減小系統(tǒng)的“彈性”，例如，在病毒蛋白和基因傳遞的研究中，缺少一個或多個片段或者某個（些）片段中存在致死性突變時，就不可能產(chǎn)生病毒樣粒子（viruslike particles，VLP）。 然而，適合于生產(chǎn)人類疫苗的細胞系（如Vero細胞）不能夠進行高效轉(zhuǎn)染。 為了解決這些問題，Neumann創(chuàng)建了一套少于以PHW2000為載體的經(jīng)典的8個質(zhì)粒反基因系統(tǒng)。 在此系統(tǒng)中減少了用于產(chǎn)生病毒的質(zhì)粒。 八個用于病毒合成的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒與一個允許插入大片段外源基因的的PTM克隆載體結(jié)合。 同樣，兩個編碼紅細胞凝集素和神經(jīng)氨酸苷酶片段的載體盒和六個編碼其他蛋白質(zhì)的載體盒結(jié)合。 另外，將用于表達聚合酶亞基的三個RNA聚合酶II 載體盒和編碼NP蛋白載體盒結(jié)合。 通過分別組合這些載體盒，顯著降低了病毒繁殖所需要的質(zhì)粒數(shù)量，分別形成了3， 4質(zhì)粒的系統(tǒng)。 生產(chǎn)甲型流感病毒的效率較傳統(tǒng)的12質(zhì)粒系統(tǒng)更高［1］，并且在新一代的細胞培養(yǎng)流感疫苗，此新系統(tǒng)更適合于生產(chǎn)流感病毒疫苗。 A型流感病毒不斷的發(fā)生變異，尤其是已有的研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)的高致病性人禽流感病毒具有高度變異的特點，需要及時更換疫苗株來確保有效疫苗的制備。 RG技術(shù)的興起，開辟了高致病性人禽流感疫苗快速制備新紀(jì)元。 通過RG技術(shù)快速制備適合中國使用的高致病性人禽流感疫苗株，建立高效拯救流感病毒的技術(shù)平臺和全面系統(tǒng)的評價體系，從而鑒定合格的疫苗株和血清標(biāo)準(zhǔn)品送WHO確認(rèn)，為高致病性人禽流感疫苗的制備奠定基礎(chǔ)，同時也為應(yīng)對流感大流行做好技術(shù)儲備。

　　3.前景展望

　　反向遺傳操作技術(shù)發(fā)展至今天，載體的選擇已經(jīng)不是什么困難的事情了，關(guān)鍵還在于構(gòu)建的策略和思路。 隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用生物信息學(xué)技術(shù)對微生物基因組序列進行分析，在不需要培養(yǎng)病原體的情況下，從大量的抗原中篩選出研制疫苗的侯選抗原。相對于傳統(tǒng)疫苗學(xué)，它減少了鑒定疫苗抗原所需的時間和花費，并能提供新的解決方案，對研究新型疫苗也有重要的參考價值［9］。 在拯救技術(shù)的日益發(fā)展成熟的基礎(chǔ)下，反向遺傳系統(tǒng)在RNA 病毒功能基因組的研究上也將擔(dān)當(dāng)無可替代的作用。 如流感M2蛋白胞漿尾被刪去5個或10個氨基酸殘基后，就會失去拯救流感病毒的能力；敲除NS2的病毒樣顆粒能用作疫苗的載體去表達外源蛋白，可以將其開發(fā)為一種復(fù)制子載體，以轉(zhuǎn)移外源基因等，都需要通過構(gòu)造突變或缺失這些序列的人工病毒來闡明其具體功能。 應(yīng)用RNA 病毒反向遺傳系統(tǒng)重現(xiàn)病毒的生活周期和感染模式，對闡明病毒的起源、致病機制和免疫交叉保護提供一種切實可行的方法。 將來可結(jié)合感染性克隆對病毒起源和致病性進行調(diào)查，開展病毒拯救的機制研究。 直到現(xiàn)在，RNA 病毒的感染性克隆是如何模擬野生病毒感染的具體機理還沒有被系統(tǒng)闡明。 另外，盡管多種疫苗已經(jīng)開發(fā)出來且實驗室證明其有效的保護作用，但禽流感的發(fā)生卻沒有被消除，這就需要從病毒反向遺傳系統(tǒng)延伸到模式生物基因組背景下的“病毒宿主反向遺傳系統(tǒng)”，從而揭示禽流感跨宿主的改變機制是什么，也為預(yù)測人類可能流感大流行的病毒株提供依據(jù)。 當(dāng)然也要正確看待病毒拯救技術(shù)的利弊，注意生物安全性，防止可能發(fā)生的病毒的流散和傳播。

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