【摘要】目的： 探討重組人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m）對γ射線輻射造血損傷小鼠的影響。 方法： 15只小鼠隨機分成3組：照射組、BMP治療組和對照組，每組5只。 照射組和BMP治療組均以60Coγ射線7.5 Gy照射200 s，對照組不接受照射。 照射后，照射組和對照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL，BMP治療組注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理鹽水稀釋液，各6 d. 照射后1， 3， 5， 7， 9， 11 d以尾靜脈采血觀察3組小鼠外周血白細胞、紅細胞及血小板變化；照射后11 d觀察照射組、BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)形成數(shù)變化。 結(jié)果： 3組間小鼠的外周血白細胞、血小板數(shù)目隨時間的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01），而外周血紅細胞數(shù)目隨時間的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 與對照組相比，照射組外周血白細胞［如（0.32±0.11）×109 vs （4.05±1.18）×109， 7 d］、紅細胞［如（6.73±1.68）×1012 vs （9.09±1.92）×1012， 7 d］、血小板計數(shù)［如（26.60±7.47）×109 vs （814.20±187.01）×109， 7 d］顯著下降 （P<0.01）；與照射組相比，BMP治療組外周血白細胞［如（1.61±0.31）×109 vs （0.32±0.11）×109， 7 d］、血小板計數(shù)［如（142.60±35.71）×1012 vs （26.60±7.47）×1012， 7 d］顯著增高 （P<0.01），外周血紅細胞數(shù)目雖然增高［如（7.38±2.22）×1012 vs （6.73±1.68）×1012， 7 d］，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)形成數(shù)顯著多于照射組（P<0.01）。 結(jié)論： BMP可提高γ射線放射損傷小鼠各系的造血細胞數(shù)目及脾結(jié)節(jié)形成數(shù)，具有促進造血功能恢復(fù)的作用。

　　【關(guān)鍵詞】  人重組骨形成蛋白2 放射損傷 造血功能 脾結(jié)節(jié)

　　0引言

　　骨形成蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）超家族。 研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮下植入重組人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m），可引起間質(zhì)細胞聚集、軟骨形成，隨之出現(xiàn)骨替代、骨髓形成及骨塑性［1］。 在大量不同的實驗研究中，rhBMP2m 表現(xiàn)出良好的誘骨活性，在臨床上對于治療骨缺損、骨折、牙本質(zhì)修復(fù)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。 rhBMP2m可減輕γ射線輻射所致的急性造血損傷，治療組小鼠的與造血相關(guān)指標(biāo)較照射對照組和對照組有顯著性增加（P<0.01），提示rhBMP2m可促進骨髓基質(zhì)細胞的分化、造血干細胞的形成及骨髓中造血干細胞的增殖，從而改善造血微環(huán)境，使輻射損傷后造血功能恢復(fù)［2-3］。 本研究旨在探討rhBMP2m對γ射線輻射造血損傷小鼠的治療作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料二級Balb/c小鼠15只，雄性，體質(zhì)量19～21 g，10周齡（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供）；rhBMP2m（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實驗中心提供）使用前溶于生理鹽水，稀釋濃度為0.5 g/L，60Coγ射線源（第四軍醫(yī)大學(xué)輻照中心）。

　　1.2方法

　　1.2.1小鼠急性放射損傷模型的建立15只小鼠隨機分成3組：對照組、照射組和BMP治療組，每組5只。 照射組和BMP治療組均以60Coγ射線7.5 Gy（劑量率221.09 cGy/min）全身照射200 s，對照組不接受照射。

　　1.2.2治療照射后，照射組和對照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL，BMP治療組注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理鹽水稀釋液，各6 d.

　　1.2.3造血指標(biāo)觀察照射后1， 3， 5， 7， 9， 11 d以尾靜脈采血，觀察3組小鼠外周血白細胞、紅細胞及血小板變化；照射后11 d頸椎脫臼法處死小鼠，取照射組和BMP治療組小鼠脾臟，加入Bouin氏液固定24 h，觀察標(biāo)本脾結(jié)節(jié)的情況并計數(shù)。

　　統(tǒng)計學(xué)處理：  數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所用統(tǒng)計學(xué)方法為重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析。

　　2.結(jié)果

　　2.1rhBMP2m對放射損傷小鼠外周血白細胞的影響3組間外周血白細胞數(shù)目隨時間的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01）。 與對照組相比，照射組外周血白細胞數(shù)目顯著減少（P<0.01），并于第7日降至最低點，第9日開始回升；與照射組相比，BMP治療組外周血白細胞數(shù)目顯著增高（P<0.01，表1）。  表1rhBMP2m對放射損傷小鼠外周血數(shù)目的影響

　　2.2rhBMP2m對放射損傷小鼠外周血紅細胞的影響3組間外周血紅細胞數(shù)目隨時間的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 與對照組相比，照射組外周血紅細胞數(shù)目顯著減少（P<0.01）；與照射組相比，BMP治療組外周血紅細胞數(shù)目雖然增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05， 表1）。

　　2.3rhBMP2m對放射損傷小鼠血小板的影響3組間外周血血小板數(shù)目隨時間的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01）。 與對照組相比，照射組外周血血小板數(shù)目顯著減少（P<0.01）；與照射組相比，BMP治療組外周血血小板數(shù)目顯著增高（P<0.01，表1）。

　　2.4小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)（32.80±8.81）， 顯著多于照射組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)（6.00±8.81，P<0.01，圖1）。 對照組小鼠因沒有受到輻射損傷，所以沒有脾結(jié)節(jié)。

　　3.討論

　　BMP可誘導(dǎo)胚胎腹側(cè)中胚層的發(fā)生，形成含有血細胞的"間質(zhì)球". BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是決定胚胎細胞向造血細胞分化的關(guān)鍵，經(jīng)過剔除編碼BMP的基因而使BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的小鼠將出現(xiàn)胚胎腹側(cè)中胚層發(fā)生障礙以及造血功能障礙［4-5］。 把BMP植入成年機體的肌肉或皮下，在誘導(dǎo)骨的同時還誘導(dǎo)骨髓的形成。 在軟骨形成后，血管侵入軟骨，小淋巴樣細胞聚集，圍繞血管出現(xiàn)大量造血干細胞，這些干細胞增殖、分化就形成造血性骨髓，這與胚胎發(fā)生時骨髓形成的過程相仿。

　　人骨形成蛋白2（human bone marrow morphogenetic protein2，hBMP2）的cDNA全長1188 bp，編碼396個氨基酸，定位于20號染色體p21區(qū)域［6］。 其被翻譯成前體蛋白后，切去氨基端的信號肽、前肽，兩個hBMP2單體再經(jīng)二聚化后分泌到細胞外。 hBMP2成熟肽含有114個氨基酸，其中包括7個在TGFβ家族中位置高度保守的半胱氨酸，6個半胱氨酸以3對鏈內(nèi)二硫鍵形成一個半胱氨酸結(jié)［7］；成熟肽N端第1～17肽存在一個肝素結(jié)合位點［8］；前肽、成熟肽、同時包括BMP家族其它成員均含有一共同的蛋白酶酶切位點RXXR［9］。 以上結(jié)構(gòu)可能和其所具有的誘骨活性，與胚胎發(fā)生、分化，神經(jīng)系統(tǒng)及造血系統(tǒng)分化、發(fā)育的誘導(dǎo)作用有密切關(guān)系。 利用基因工程技術(shù)，獲得重組人骨形成蛋白2 （rhBMP2）。

　　機體受到輻射時產(chǎn)生大量的自由基，引起生物大分子的損傷、DNA鏈斷裂、染色體畸變，引起突變、誘發(fā)腫瘤、造成早衰和壽命縮短等現(xiàn)象；同時，造血組織對輻射敏感，機體受照后造血組織變化的嚴重程度和照射劑量關(guān)系密切。 電離輻射不僅可以引起骨髓血竇的損傷，也能抑制和破壞造血干細胞（hematopoietic stem cells， HSC）［10］。 HSC是產(chǎn)生各系血細胞的最原始細胞，是維持機體正常造血、保證損傷后重建造血的關(guān)鍵細胞。 骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow stromal cells， BMSC）又被稱為間質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells， MSC），它具有多向分化的潛能，同時能分泌多種造血生長因子和多種細胞黏附分子，對維持造血也有很重要的作用。 BMSC和細胞外基質(zhì)在體內(nèi)共同構(gòu)成造血微環(huán)境支持并參與調(diào)節(jié)HSC及其子代細胞的靜止、自我更新，干細胞的定位、增生、成熟，以及過成熟細胞的凋亡［11］。 免疫功能與造血功能密切相關(guān)，輻射能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持久的影響。 受照后，機體巨噬細胞、CD3+/CD8+T細胞和自然殺傷NK細胞顯著下降，且與照射劑量呈正相關(guān)，直接導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能的低下和紊亂，而引起感染造成機體死亡［12］。 而接受大劑量放療后的腫瘤患者和急性放射病患者的骨髓造血抑制，引起嚴重感染等并發(fā)癥是病人死亡的主要原因。

　　對人體多種造血細胞的檢測結(jié)果表明，這些細胞在正常狀態(tài)下分泌hBMP2，在正常造血組織中也可檢測到hBMP2［13］，同時正常骨髓造血干細胞表面表達BMPII型受體。 將BMP2植入成年動物的肌肉或皮下，在植入局部誘導(dǎo)間質(zhì)細胞形成骨、軟骨細胞和誘生新的造血灶。［醫(yī)學(xué)教育 網(wǎng) 搜集整理］

　　本實驗中，三組間小鼠的外周血白細胞、血小板數(shù)目隨時間變化的差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01），而外周血紅細胞數(shù)目隨時間的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 與對照組相比，照射組外周血白細胞、紅細胞、血小板計數(shù)顯著下降（P<0.01），表明輻射對小鼠造血功能有損傷作用，其中粒細胞和血小板減少程度尤其明顯，提示小鼠受到輻射后出現(xiàn)造血干細胞急劇減少；與照射組相比，BMP治療組的外周血白細胞計數(shù)和血小板計數(shù)均顯著增高 （P<0.01），外周血紅細胞數(shù)目雖然增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），可能與實驗動物數(shù)量偏少有關(guān)。 脾結(jié)節(jié)測定法是檢測小鼠造血干細胞在脾臟定居和形成集落能力的方法。 照射后，照射組小鼠脾臟有少量脾結(jié)節(jié)形成，提示機體可能仍有少量造血干細胞存活；同時BMP治療組小鼠脾臟有大量脾結(jié)節(jié)形成，其數(shù)目與照射組比較有非常顯著的差異（P<0.01），且BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)的形態(tài)和大小存在差異，推測可能是由于不同系造血祖細胞定居于脾臟而形成的結(jié)果。 實驗結(jié)果說明BMP2對輻射所致造血損傷的修復(fù)或?qū)υ煅拇龠M作用是對全血細胞性的作用。 無論是輻射或是化療藥物所引起的造血損傷都是一種對各系造血細胞全面的損傷。 我們先前的實驗曾經(jīng)證實BMP促進造血損傷的作用優(yōu)于GMCSF，其原因可能為GMCSF只是針對GM系列的細胞，而BMP則是對各系細胞均有促進修復(fù)、增殖的作用可能是因為BMP誘導(dǎo)造血因子釋放，或者其本身即為造血因子。 rhBMP2通過什么樣的途徑誘導(dǎo)促進了造血的修復(fù)？這有待于進一步的研究。

　　【參考文獻】［1］ Saito N， Okada T， Horiuchi H， et al. Local bone formation by injection of recombinant human bone morphogenetic protein2 contained in polymer carrier ［J］。 Bone，2003，32（4）：381-386.

　?。?］ 田瓊，張紹章，蒲勤，等。 重組人骨形成蛋白2成熟肽對小鼠輻射損傷的治療作用及其機理的探討［J］。 中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志，1998，18（4）：253-255.

　?。?］ 田瓊，張紹章，蒲勤，等。 骨形成蛋白對小鼠造血型急性放射損傷治療作用的研究［J］。輻射研究與輻射工藝學(xué)報，2001， 19（3）： 199-203.

　?。?］ Winnier G， Blessing M， Labosky PA， et al. Bone morphogenetic protein4 （BMP4） is required for mesoderm formation and patterning in the mouse ［J］。 Genes Dev，1995，9（17）：2105-2116.

　　［5］ Kishimoto Y， Lee KH， Zon L， et al. The molecular nature of zebrafish swirl：BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning ［J］。 Development，1997，124（22）：4457-4466.

　?。?］ Wozney JM， Rosen V， Celeste AJ， et al. Novel regulators of bone formation： Molecular clones and activities ［J］。 Science，1988， 242（4885）： 1528-1534.

　　［7］ Scheufler C， Sebald W， Hulsmeyer M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein2 at 2.7  resolution ［J］。 J Mol Biol，1999，287（1）：103-115.

　?。?］ Ruppert R， Hoffmann E， Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparinbinding site which modifies its biological activity ［J］。 Eur J Biochem， 1996，237（1）：295-302.

　?。?］ Celeste AJ， Iannazzi JA， Taylor RC， et al. Identification of transforming growth factor β family members present in boneinductive protein purified from bovine bone ［J］。 Proc Natl Acad Sci USA，1990，87（24）：9843-9847.

　　［10］ Dainiak N. Hematologic consequences of exposure to ionizing radiation ［J］。 Exp Hematol， 2002，30（6）：513-528.

　?。?1］ Lemischka IR. Microenvironmental regulation of hematopoietic stem cells ［J］。 Stem Cells， 1997，15（1）：63-68.

　?。?2］ Pecaut MJ，Gridley DS，Nelson GA. Longterm effects of lowdose proton radiation on immunity in mice： Shielded vs Longterm effects of lowdose proton radiation on immunity in mice：shielded vs unshielded ［J］。 Aviat Space Environ Med， 2003，74（2）：115-124.

　　［13］ Detmer K， Steele TA， Shoop MA， et al. Lineagerestricted expression of bone morphogenetic protein genes in human hematopoietic cell lines ［J］。 Blood Cells Mol Dis， 1999，25（56）：310-323。