登革熱診斷標準及處理原則附錄B：登革熱病原學檢測

B1應用單克隆抗體免疫熒光法（mbAb-IFA）檢測DV抗原

B1.1原理

感染DV的蚊蟲體內，攜帶有DV抗原，可用DV單克隆抗體免疫熒光法檢出蟻體內的特異性抗原。

B1.2材料

多孔載玻片、10～l00 μL可調加樣器、染色缽、試管、pH7.2PBS Dl～D4型單克隆抗體、羊抗鼠IgG、丙酮等。

B1.3檢測步驟（問接法）

B1.3.1 蚊蟲標本制備：待蚊蟲胃內容物消化后，置-40℃凍死，用解剖刀去翅，肢，將頭部和軀體分別放于載玻片圈內，蓋上一塊與之相對應的玻片，輕輕加壓，使蚊組織最大限度地附在玻片上，小心分開兩玻片，用鑷子去除大片的骨骼，吹干，冷丙酮固定10 min.

B1.3.2用PBS輕輕洗一次，再用蒸餾水洗一次，吹干。

B1.3.3加DF單克隆抗體，覆盞蚊組織，置于濕盒中，37℃水浴30 min.

B1.3.4取出，用PBS洗2次，蒸餾水洗1次，吹干。

B1.3.5加羊抗鼠lgG，如B1.3.3、B1.3.4，孵育，洗滌。

B1.3.6封片膠封片，熒光鏡檢。如單抗已熒光標記則免去BI. 3.5，即為直接法。

B1.4結果判斷

用熒光顯微鏡觀察，檢出組織細胞質內有特異性黃綠色熒光，判為陽性醫(yī)|學教育網整理，陰性無熒光出現(xiàn)。

B1.5 意義

在蚊蟲組織中，檢出DV抗原。可確診被檢蚊蟲攜帶有DV，可用于登革熱流行病學調查。

B2 C6/36白紋伊蚊細胞分離DV

B2.1原理

DV是一種具有嚴格的細胞內存活的生物，必須生活在活的細胞組織內。C6/36白紋伊蚊細胞對DV十分敏感，藉觀察病毒對其產生的變化（病變等現(xiàn)象）和應用特異、敏感的檢測技術，檢出病毒的存在和型別。

B2.2材料

C6/36白紋伊蚊細胞、新生小牛血清、日本Eagles、青霉索、鏈霉素、各型DV單克隆抗休、羊抗鼠熒光IgG及免疫熒光試驗用品。

B2.3檢材的采集及處理

B2.3.1病人：無菌采集發(fā)病后5d內靜脈血3 mL.放冰壺送實驗室分離血清接種組織培養(yǎng)，不能及時接種的可放-20℃保存。對污染的血漬要先加青霉索、鏈霉素（最終濃度各為500 kU/L）。4℃作用2h處理后按種。接種后余下的血消為早期血清，供血濟學試驗用。

B2. 3.2尸體檢材：可取血，腦行液、腦組織、肝等。

B2.3.3蚊：采集吸過血的埃及伊蚊。白紋伊蚊或其他可疑蚊種，用0.50 mol/L（10%）葡萄搪液喂養(yǎng)，至胃血完全消化后置-20℃，待死后按蚊種及捕獲地點分組，以5～10只一組為宜，經生理鹽水沖洗數次后，用研磨器研碎，每組加0.5 mL Hank's液，2 000 r/min離心15 min，取上清液加青霉素、鏈霉素【最終濃度1 MU/L（1 000 U/mL）】4℃過夜，備用。

B2.4病毒分離

C6136（白紋伊蚊純系細胞株）傳代細胞。待細胞長成單層后，倒去培養(yǎng)液，每管接種月Hank's液稀釋成10-1的患者血清0.1mL或蚊懸液或組織懸液0.2 mL，37℃吸附l h后加維持液0.9 mL及0.8mL，置35 ℃靜止培養(yǎng)，觀察7天，若細胞出現(xiàn)膨大至融合，折光度增強、顆粒增多等現(xiàn)象，取細胞懸液0.1 mL，進行傳代，仍出現(xiàn)同樣病變者應保種并進行鑒定，若7天后細胞不出現(xiàn)病變，需盲傳l～2代，仍不出現(xiàn)病變者用問接免疫熒光試驗作進一步檢查，陰性者作陰性報告。

B2.5間接免疫熒光試驗（FA/IFA）鑒定DV

B2.5.1 試驗方法

B2.5.1.1 細胞片的制備：把出現(xiàn)“++”病變的C6/36細胞管倒去維持液，（若不出現(xiàn)病變醫(yī)|學教育網整理，則需培養(yǎng)7天再制片）用pH7. 2PBS洗2次后加PBS 3 mL，用滴管把細胞從管壁上吹下，吹散，2 000 r/min離心5 min，棄去PBS.加O～2 mLPBS把沉淤吹散，滴加在10孔的載玻片符孔中，電風扇吹干，加冷丙酮固定10 min，用PBS沖洗2次，蒸餾水漂洗1次，吹干，-20℃保存。正常C6/36細胞對照按同法制片。

B2.5. 1.2試驗方法：取出保存的待鑒定細胞片或腑組織片，吹干，于各孔中按順序滴加4個型DV使用單位的單克隆抗體，備型2孔，對照2孔滴加PBS，置濕盒內37℃水浴30 min.取出用PBS沖洗3次，蒸餾水深洗1次，吹干，滴加含130 μmol/L（1 ：8 000）伊文思蘭的2單位抗鼠IgG熒光抗體，置濕眾內37℃水浴30 min，用PBS沖洗3次，蒸餾水漂洗1次，吹干，用甘油緩沖液封片，鏡檢，記錄結果。

B2.5.2結果判斷

特異性免疫熒光呈黃綠色顆粒，分布在感染細胞的胞漿內，正常組織細胞被染成橙紅色或暗紅。

B2.5.3意義

從病人血液、組織或蚊媒中分離出DV，經鑒定，可確診DV感染和病毒型別。

B3應用乳小白鼠分離DV

B3.1原理

新生小白鼠對DV十分敏感，藉觀察病毒對其產生的致病等現(xiàn)象和應用特異、敏感的檢測技術，檢出病毒的存在和型別。

B3.2材料

同B2.2.C6/36白紋伊蚊細胞改用1～3日齡乳小白鼠。

B3.3檢材采集及處理

參考B2.3.

B3.4病毒分離

每一檢材接種一窩l～3日齡小白鼠，每只腦內接種全血或1：10血清或蚊懸液、組織懸液10～20μL，接種后48 h內死亡者作非特異性死亡，棄去。存活者觀察至10 d左右仍未發(fā)病時，剖取其中2只， 取腦，用pH8.0肉湯制成10%懸液，盲傳1～3口齡小白鼠一窩，其余的及盲傳的均觀察至第四周。未發(fā)病作陰性結果：在觀察期內若發(fā)病（松毛、蜷縮、活動力降低、站立不穩(wěn)、抽搐、離群、不進食、癱瘓等癥狀）則削取半邊腦，按盲傳法制成10%鼠腦懸液，轉種1～3日齡小白鼠，并作無菌試驗。另一半腦置5.43 mol/L（50%）甘油緩沖液中低溫保存。無菌試驗陰性而重復以上癥狀的乳鼠作為可疑毒株傳代、保種，并進行鑒定。

B3.5病毒鑒定

B3.5.1 問接免疫熒光試驗（FA/IFA）

B3.5.1.1 腦組織片的制備；取發(fā)病瀕死的小鼠腦組織以冰凍切片制成10孔組織片，經吹干，冷丙酮固定10 min，沖洗、吹干后放-20℃保存。正常腦組織同法制作。

P.3.5.1.2試驗方法、結果和意義，同B2.5.

B3.5.2血凝抑制試驗

原理、材料與方法參考人2.

意義：鑒定病毒和病毒分型。

a3.5.3補體結合試驗

原理、材料與方法、意義參考A3.

s3.5.4中和試驗

原理、材料與方法、意義參考A6.

B4 RT-PCR技術檢測DF病毒基因及基因分型

B4.1原理

PCR技術（聚合酶鏈反應）是利用雙鏈脫氧核糖核酸（DNA）分子堿基配對原則，在一定條件下擴增DNA片段的體外擴增方法。它的特異性取決于兩個人工合成的寡核苷酸引物的序列。引物與待擴增片段兩條鏈兩段DNA序列分別互補，待擴增DNA在變性溫度下分解為二條單鏈模板。在復性溫度引物與模板兩端的DNA序列分別復性（雜交，堿基配對）。在延伸溫度和單核背酸存在的條件下，由TaqDNA聚合酶催化，引導引物的5，向3，方向延伸合成新鏈，是一個重復進行的熱變性復性延伸的溫控循環(huán)過程，隨著循環(huán)次數的增加，DNA產量呈指數上升，經過20個循環(huán)以后，從微量基因材料。特異性地擴增可達數百萬倍。

登革病毒含核糖核酸（RNA）基因組，因此PCR前需經過逆轉錄酶作用。合成第一條cDNA鏈（RT），再進行擴增（PCR），即RT-PCR.設計一對通用引物可擴增登革病毒組基因。設計不同型登革病毒的引物對，可擴增出不同的基因型病毒的基因產物。

B4.2材料及方法

（略）。

B4.3 意義

此法可對早期病例DV的檢測及分型鑒定。