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根據(jù)實驗室的實際情況,我們將其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有許多可改進或需要注意的地方,其中有一些對普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。
1、所用器具的潔凈程度。這一點非常重要,是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的,毋庸置疑。
2、培養(yǎng)基的裝量:培養(yǎng)基的裝量是很重要的,這關(guān)系到菌體生長過程中的能量代謝問題,是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為:培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml.
3、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值,而且還包括整個搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來說,接種前的pH值在6.8-7.2,等菌搖好后,可以測一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝,生長狀態(tài)良好,按要求做,肯定效率不低。
4、培養(yǎng)后的OD值。其實這并非一個非常重要的參數(shù),只是當(dāng)OD值大到一定的程度后,菌體要保持對數(shù)生長已經(jīng)不太可能,因此很多指導(dǎo)方法上強調(diào)OD不得大于0.6,0.8等等。同時,OD值大時菌體總量大,因而感受態(tài)絕對數(shù)量要大一點,因而需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。
5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗證明,當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時,該方法制得的感受態(tài)要相對較高。在制備普通感受時,使用20mMMgCl2做為培養(yǎng)基的添加物,在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入,會收到很好的效果。
6、培養(yǎng)溫度。文獻及經(jīng)驗告訴我們,較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成,這樣可以獲得較高的感受態(tài),但太低又不實用,因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法,它實際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻而得出的一個非常理想方法。
7、此外文獻報道,在保存感受態(tài)時,DMSO要比甘油的效果要好,它會使感受態(tài)的效率增加。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜|索整理
8、液氮速凍也會使感受態(tài)的效率提高,因此推薦用液氮速凍感受態(tài),然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱,這點未做實驗,只是一種感覺,第一次這樣做了,沒問題,以后就照此辦理而已。